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Protokoll für den viertenVersuch des BC-Praktikums...

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Praktikum Biochemie für Studierende der Biologie und Chemie an der Universität Bremen

Protokoll zum Versuch 4: PCR

Universität Bremen Biologie Vollfach

1. Einleitung: Bei der Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction; PCR) handelt es sich um eine biochemische Methode, um Genmaterial zu amplifizieren und anschließend mithilfe einer Gelelektrophorese in Agarose aufzutrennen und zu identifizieren. Die in dem Versuch verwendete DNA stammt von einer Maus (Mus musculus) und ist eine genomische Aktin-DNA. Das Amplifikationsprodukt besitzt eine Länge von 417 Basenpaaren. Der Verdau des Produkts für die Probe 2B wird mithilfe des Enzyms SMA-I durchgeführt. Es gehört zu den Restriktionsenzymen der Enzymklasse 2 und schneidet die DNA an bestimmten Palindrom-Schnittstellen. Es wirkt sehr spezifisch an genau dieser einen individuellen Palindrom-Sequenz und hinterlässt an der Schnittstelle “Blunt ends”. Indem es direkt senkrecht zwischen CCC und GGG schneidet, entstehen glatte Enden. Es ist zu erwarten, dass durch diesen Vorgang das 417 Nukleotide umfassende PCR-Produkt in 73 und 344 Nukleotiden lange Doppelstränge aufgeteilt wird.

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2. Material und Methoden: Das Material und die Methoden sind dem Praktikums-Skript „Praktikum Biochemie für Studierende der Biologie und Chemie an der Universität Bremen“ (Fassung 2018) zu entnehmen. Als Abweichungen sind die größere Menge des Gel-Reds™ zu nennen (4 µl statt 3 µL), sowie die Änderung der Spannung während der Gelelektrophorese von 120 V auf 140 V und die damit einhergehende verkürzte Durchlaufzeit von 60 auf ca. 45 Minuten.

Prof. Dr. Ralf Dringen: Praktikumsskript zum „Praktikum Biochemie für Studierende der Biologie und Chemie an der Universität Bremen“ (2018) 1

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3. Ergebnisse:

Abb. 1 : Ergebnisse der Gelelektrophorese der PCR-Ansätze Die beschrifteten Banden zeigen die Resultate unserer Arbeitsgruppe. Die in der Mitte befindlichen Banden zeigen den Standardansatz, der für beide Arbeitsgruppen genutzt wurde. Ansatz 1: 5 𝜇L DNA, 1 𝜇L H2 O,  14 L Mastermix (siehe Skript) Ansatz 2A: 5 𝜇L DNA, 14 𝜇L Mastermix, 1 𝜇L Taq-Polymerase Ansatz 2B: siehe Ansatz 1, anschließend verdaut mit SMA-I Ansatz 3: 5 𝜇L H2 O,  14 𝜇L Mastermix, 1 𝜇L Taq-Polymerase

Der Standardansatz dient mit seinen Banden als Referenz für alle anderen gemessenen Banden der Versuchsansätze. Die Länge der DNA-Fragmente (in bp) und die Bandenanzahl ist hier bekannt. Sie umfasst die erwarteten 13 Banden von 1031 bis 50 Basenpaaren (bp).

Ansatz 1: In der Laufbahn von Ansatz 1 sind im Gel keine Banden zu erkennen. Ansatz 2A: Auf der Strecke von Ansatz 2A sind insgesamt drei Banden zwischen der 500bpund 400bp-Bande, zwischen der 200bp- und 250bp-Bande sowie zwischen der 100bp- und 150bp-Bande zu sehen. Ansatz 2B: Im Ansatz 2B ist die untere Bande auf derselben Höhe wie die am weitesten gelaufene Bande von Ansatz 2A (zwischen der 100bp- und 150bp-Bande). Auch die darüber befindliche Bande ist ebenso weit gelaufen, wie die zweite Bande in Ansatz 2A (zwischen 2

der 200bp- und 250bp-Bande). Außerdem ist noch eine Bande auf der Höhe zwischen der 300bp- und der 400bp-Bande auszumachen. Ansatz 3: Im Ansatz 3 ist nur eine sehr schwache Verfärbung (als Bande zu beschreiben) unterhalb der 50bp - Bande zu erkennen.

Abb. 2: Das gegebene Diagramm zeigt die Relation zwischen Laufstrecke und Basenpaar-Anzahl im Molekulargewichtstandard mit der dazugehörigen Kalibrierungsgeraden. Der Graph wird durch folgende Funktion beschrieben:

3. a) Berechnung der Fragmentlängen der PCR-Produkte Die Formel in Abb. 2 ermöglicht eine Ermittlung der Basenpaar-Anzahl der DNA-Fragmente 2A und 2B auf Basis ihrer Laufstrecken (Tab. 2, Anhang).

Ansatz 2A: a) x = 5.1 (cm) - 0.2287698588 * 5.1 (cm) + 3.7549353163 = 2.588 10 ^2.588 = 387,257 387 Basenpaare

3

Ansatz 2B: a) x = 5.5 (cm) - 0.2287698588 * 5.5 (cm) + 3.7549353163 = 2.497 10 ^2.497 = 314,051 314 Basenpaare Ansatz 2A & 2B: a) x = 7.3 (cm) - 0.2287698588 * 7.3 (cm) + 3.7549353163 = 2.085 10 ^2.085 = 121,619 121 Basenpaare b) x = 6.4 (cm) - 0.2287698588 * 6.4 (cm) + 3.7549353163 = 2.291 10^2.291 = 195,434 195 Basenpaare

4. Diskussion: Bei der Auswertung der Gelelektrophorese fällt auf, dass Ansatz 2A drei Banden aufzeigt, obwohl es nicht mit dem Restriktionsenzym in Berührung kam. Außerdem ist zu bemerken, dass sich auf genau derselben Höhe auch bei 2B zwei Banden befindet. Die Tatsache, dass diese Banden in beiden 2er Ansätzen auftaucht, verschärft die Annahme, dass es zu Fehlern während der PCR gekommen sein muss, was z.B. durch eine nicht optimale Mg2 -Konzentration oder eine unspezifisch wirkende Polymerase ausgelöst werden könnte. Ein weiterer Grund für diesen zusätzlichen Abschnitt kann die Annealingtemperatur gewesen sein (siehe 4.a)), die das Bindungsverhalten der Polymerase maßgeblich beeinflussen kann.

Prof. Dr. Ralf Dringen: Praktikumsskript zum „Praktikum Biochemie für Studierende der Biologie und Chemie an der Universität Bremen“ (2018) 2

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4. a) Berechnung des Temperatur-Optimums der Primer Die optimale Annealing-Temperatur lässt sich mit der im Skript erwähnten Formel berechnen: Ta = [(Anzahl der G- und C-Nucleotide) * 4 + (Anzahl der A- und T-Nucleotide) * 2] -5 (C°) 3 Die in der eckigen Klammer befindliche Formel beschreibt die Schmelztemperatur der Primer. Wendet man die gegeben Formal auf unsere Primer an, ergeben sich folgende Werte:

Primer 1: Ta = [(12) * 4 + (8)* 2] - 5 = 59 °C

Primer 2: Ta = [(11) * 4 + (6) * 2 )] - 5 = 51 °C

Die Optimaltemperatur der Primer verändert sich somit um einen Wert von ca. 8 Grad. Bei einer zu immensen Abweichung der Temperatur vom Optimum kann es zu Fehlern bei der PCR kommen. Zu niedrige Temperaturen führen dazu, dass häufiger unspezifische Anbindungen, z.B. an anderen Stellen des Actins, vorkommen. Eine zu hohe Gradanzahl hingegen kann dazu führen, dass sich der Primer von der DNA ablöst bzw. nicht mehr an sie binden kann. Der Annealing-Prozess wurde bei einer Temperatur von 53 °C durchgeführt. Es ist somit naheliegend, dass sich der erste Primer eventuell falsch angelagert hat. Dies würde auch das Entstehen der unteren Markierungen in Ansatz 2A und 2B erklären. In der Regel unterscheidet sich die Länge und Abfolge der Basen unter den beiden verwendeten Primern. Um trotz allem ein möglichst gutes Ergebnis für die PCR zu erhalten, ist es wichtig, dass man sich an der niedrigeren der beiden ausgerechneten Temperaturen orientiert und sie dann nur geringgradig erhöht. Wird eine zu hohe Temperatur gewählt, riskiert man, dass der Primer mit dem niedrigeren Temperaturoptimum denaturiert wird und somit nicht mehr binden kann.

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Das Gelelektrophorese-Bild und die Berechnungen bzgl. des Temperatur-Optimums verstärken die These, dass die theoretisch erwartete Länge der DNA-Sequenzen nicht mit den tatsächlich vorliegenden Produkten übereinstimmen. Die unspezifische Anlagerung des ersten Primers hat dazu geführt, dass die Template-DNA nicht immer wie erwartet amplifiziert wurde und somit ein weiteres, kleineres Amplifikat entstanden ist.

Um diese Theorie zu verifizieren, lassen sich mit Hilfe der Geradengleichung die Länge der Nukleinsäuren berechnen (siehe Ergebnisse 3. a)).

Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die vorliegenden Fragment-Längen nicht exakt mit den theoretisch ausgemachten Nukleotidenanzahlen übereinstimmen.

Die Bande im Ansatz 2A auf Höhe des 400bp-Bande des Markers gelaufen ist, entspricht mit kleinen Abweichungen den Erwartungen der PCR. Auch die erste Bande aus dem Ansatz 2B stimmt ungefähr mit der zu erwartenden Länge überein. Die geringen Unstimmigkeiten können aus einer ungenauen Messung der nur schwach zu erkennenden Banden resultieren.

Als Ursachen für die Abweichungen können, neben den bereits erwähnten unspezifischen Bindungen der Primer, außerdem noch Verunreinigungen in der Probe und eine zu hohe Magnesium-Konzentration in Betracht gezogen werden. Magnesium wirkt in dieser Reaktion als Cofaktor und als Energieträger. Es ist zweifach positiv geladen und geht daher mit der negativ geladenen DNA eine Bindung ein. Es entstehen lösliche Komplexe mit der Template-DNA und den Primern. Somit wird die Bindung dieser beiden Komponenten stabilisiert.

Wird

eine

zu

hohe Menge an Magnesium hinzugegeben,

ist die

Wahrscheinlichkeit größer, dass es zu unspezifischen Bindungen kommt, da die Magnesium-Ionen die Ladungen der DNA ausgleichen könnten. 4 Zu guter Letzt, sollte beachtet werden, dass Messfehler nicht auszuschließen sind. Die Zentren der Markierungen in der Gelektrophorese sind nur über Augenmaß ermittelt worden, somit

können bereits

geringe Ungenauigkeiten hier

Basenpaaranzahl führen.

4

Seminar zum Praktikum Versuch 4 (20.09.2018)

6

zu

einer Abweichung

der

Die Tatsache, dass die Banden in 2A und 2B größtenteils sehr ähnlich verteilt sind, lässt die Vermutung aufkommen, dass die Produkte aus 2B von 2A zum Teil übernommen wurden. Das kann passieren, wenn die DNA unvollständig verdaut wurde. Diese Fehler können beispielsweise während der Inkubation, dem Ansetzen des Ansatzes oder der Zeit des Verdaus aufgetreten sein. Außerdem muss erwähnt werden, dass es sich bei dem SMA-I um ein recht fehleranfälliges Restriktionsenzym handelt. 5

Der kürzere Strang von den erwarteten 73 Basenpaaren in 2B ist jedoch nicht auf dem Gel auszumachen. Das liegt an dem verwendeten Färbemittel Gel Red™. Der Farbstoff interkaliert in der DNA. Damit dies geschieht, muss die anzufärbende Nukleinsäure ein Mindestmolekulargewicht aufweisen. Diese Nachweisgrenze beträgt 5 ng Nukleinsäure. 6 Offenbar erfüllt die kurze Sequenz diese Bedingung nicht und hat ein zu geringes Gewicht um eingefärbt zu werden. Es wäre für diesen Versuch demnach eine Überlegung wert gewesen, ein sensibleres Färbemittel oder vielleicht eine längere DNA-Sequenz zu nutzen, um den kurzen DNA-Strang ebenfalls ausmachen zu können.

Im Ansatz 3 ist eine leicht durchschimmernde Bande zu erkennen, obwohl sich keine Template-DNA in dieser befindet. In diesem Fall handelt es sich vermutlich um die in der Lösung befindlichen Primer, die im Überschuss eine sogenannte “Primer-Wolke” entstehen lassen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Annealingtemperatur nicht passend gewählt wurde und dass der Verdau nicht wie erwartet durchgeführt worden ist. Unter anderem dadurch sind abweichende Resultate in der PCR und der anschließenden Gelelektrophorese entstanden.

5 6

Seminar zum Praktikum Versuch 4 (20.09.2018) Seminar zum Praktikum Versuch 4 (20.09.2018)

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5. Anhang: Tab. 1: Werte des Molukulargewichtsstandards Die Tabelle enthält die Laufstrecke der Marker-Banden in cm und den Logarithmus der Basenpaare (Skript entnommen).

Laufstrecke [cm]

log (bp)

bp

3

3,0132586653

1031

3,4

2,9542425094

900

3,6

2,903089987

800

3,9

2,84509804

700

4,3

2,7781512504

600

4,7

2,6989700043

500

5,2

2,6020599913

400

5,8

2,4771212547

300

6,2

2,3979400087

250

6,6

2,3010299957

200

7,1

2,1760912591

150

7,7

2

100

8,3

1,6989700043

50

Tab. 2: Werte der Ansätze 2A & 2B Die Tabelle zeigt die gemessenen Banden im Ansatz 2A und 2B nach der Gelelektrophorese

Banden

2A Laufstrecke [cm]

2B Laufstrecke [cm]

1

5.1

5.5

2

7.3

7.3

8

6. Literatur: Berg, Jeremy M., Stryer, Lubert, Tymoczko, John L: Stryer Biochemie (2012), Springer Spektrum-Verlag, 7. Auflage

Prof. Dr. Ralf Dringen: Praktikumsskript zum „Praktikum Biochemie für Studierende der Biologie und Chemie an der Universität Bremen“ (2018)

Seminar zum Praktikum Versuch 4 (20.09.2018)

http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/16/biochem/pcr/pcr_praxis/praxis.vlu/Pa ge/vsc/de/ch/16/biochem/pcr/pcr_praxis/taq.vscml.html (23.09.2018)

http://www.math.uni-bremen.de/stochdyn/~mhk/preprints.html (24.09.2018)

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