Biologie de la reproduction des plantes à fleur PDF

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UE biologie et physiologie végétale – J.L. Magnard Chap I – Biologie de la reproduction des plantes à fleur Rappels a) D’un gène à une fonction La séquence codante est formée d’exons et d’introns. Le promoteur se situe devant la séquence codante et permet de réguler la transcription (départ et arrêt), il est formé de « box » (boites) sur lesquelles viennent se fixer des protéines appelées des facteurs de transcription. Il y a des facteurs de transcriptions activateurs (active la transcription) ou répresseurs (réprime la transcription). L’ARN polymérase vient s’accrocher à l’ADN au niveau du promoteur (TATA box), puis il va se passer une sorte de dialogue entre les protéines et l’ARN polymérase. L’ARN polymérase va intégrer les informations associées au promoteur : s’il y a plus de « + » que de « - » : la transcription commence et s’il y a plus de « » que de « + » : la transcription ne commence pas. Un gène ne pourra être transcrit que dans une cellule où il y aura suffisamment de facteurs activateurs (« + »). Le « +1 » est la première base de l’ARN par convention. Une fois que l’ADN est transcrit, il y a excision des introns et épissages des exons. Puis il y a traduction. b) Niveaux de régulation Toutes les cellules d’un individu ont la même information génétique, cependant toutes les cellules ne se ressemblent pas. Les cellules ont le même équipement en termes de gènes mais elles ne l’utilisent pas de la même façon. Exemples (voir diapo) :  Le gène 1 est transcrit et traduit seulement dans le xylème : cette régulation est appelée régulation transcriptionnelle.  Le gène 2 est transcrit dans les trois tissus (xylème, phloème, parenchyme), puis il est traduit en protéine dans le xylème et le phloème mais dans le parenchyme l’ARN est modifié et ne pourra plus être traduit : c’est la régulation post transcriptionnelle.  Le gène 3 est transcrit et traduit dans les trois tissus, mais la protéine 3 est inactive après sa production, sauf s’il y a une modification de cette protéine, cette modification a lieu seulement dans le parenchyme, la protéine 3 est active seulement dans le parenchyme : c’est la régulation post traductionnelle. A partir du même équipement génétique, on peut faire des choses différentes.

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I – Le développement de la fleur chez les angiospermes Arabidopsis thaliana : à la base de la plante, on observe une rosette de feuilles (feuilles insérées au même endroit sur la racine), 98% de la vie de la plante se passe sous forme de rosette, puis la plante fleurie en produisant une longue tige à partir de la rosette. Le long de cette tige il y a quelques feuilles, et à intervalle régulier il y a production de fleurs (plus on va vers le sommet, plus les fleurs sont serrées). Cette plante produit une inflorescence (un ensemble de fleurs). De l’extérieur vers le centre : sépales, pétales, étamines, pistil : quatre verticilles (groupes de pièces florales) inclus les uns dans les autres. Comment passe-t-on d’un méristème végétatif à un méristème floral puis à une fleur ?

La première image représente le sommet de la hampe florale au moment où elle n’a donné que des feuilles. Un méristème apical se situe au sommet de la hampe florale : il est formé de cellules en division (une plante est une tige, des feuilles et une racine, il y a donc deux méristèmes : méristèmes apical au sommet de la tige et le méristème racinaire au niveau de la racine). A un moment, la plante va arrêter de produire des feuilles pour produire des fleurs : c’est la floraison. La deuxième image représente la floraison, le méristème apical est toujours là et il forme des méristèmes floraux qui vont se développer et se transformer en fleurs. La tige grandit et forme des méristèmes floraux à intervalles plutôt réguliers. 1. Le contrôle de la mise à fleur

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Pourquoi le contrôle de la mise à fleur est essentiel ?  Il y a des périodes plus favorables pour fleurir que d’autres (fin du printemps, été…) ;  La plante va devoir se reproduire et interagir avec d’autres individus de la même espèce, il faut donc que les plantes de la même espèce fleurissent en même temps. Les signaux qui vont être responsable de la floraison sont de deux types : les signaux externes : -la lumière, -la température ; et un signal interne : -le stade de développement. a) Le signal lumière : la photopériode La photopériode est le ratio (le rapport) en une journée entre la durée de la phase lumineuse (jour) et la durée de la phase sombre (nuit). Lorsque la durée du jour est plus faible que la durée de la nuit : c’est un régime de jour court, au contraire, lorsque la durée du jour est plus importante que la durée de la nuit : c’est un régime de jour long. Certaines plantes fleurissent lorsque la durée de la phase sombre est plus longue que la durée de la phase lumineuse : ce sont les plantes de jour court (ex : le chrysanthème). Certaines plantes fleurissent lorsque la durée de la phase lumineuse est plus longue que la durée de la phase sombre : ce sont les plantes de jour long (ex : arabidopsis thaliana). Quelques plantes ne sont pas affectées par la photopériode : ce sont les plantes indifférentes. Expériences : SDP (plante de jour court), LDP (plante de jour long). Lorsque qu’un flash lumineux est envoyé pendant quelques minutes sur une LDP pendant la nuit, elle est capable fleurir. On peut donc inhiber l’effet d’une nuit longue grâce à un flash lumineux de quelques minutes pendant la nuit. Cette expérience marche seulement avec de la lumière blanche et de la lumière rouge. La longueur d’onde qui peut provoquer cet effet est située dans le rouge, autour de 660 nm.

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La lumière rouge est active sur une molécule appelée le phytochrome. Le phytochrome est formé d’une partie protéique associée à une antenne de perception de la lumière non protéique : appelée un chromophore ; et d’une enzyme nommée : domaine kinase. Le phytochrome est un photorécepteur de l’organisme végétal Rappel : le phytochrome Il existe deux états pour le phytochrome : un état inactif (kinase inactive) nommé « Pr » dont le maximum d’absorption se situe à 660 nm ; et un état actif (kinase active) nommé « Pfr » dont le maximum d’absorption se situe à 720 nm. Lorsque le chromophore perçoit la lumière rouge, le groupement D change de position et rend le phytochrome actif ou inactif selon la longueur d’onde perçue. Le phytochrome est activé par la lumière rouge de longueur d’onde située autour de 660 nm, ce qui produit en suite une activité enzymatique qui permet la floraison. Les gènes sont aussi impliqués dans le processus de floraison.

Expérience : on utilise un stimulus : le jour long. Les plantes vont toutes fleurir sauf les mutants pour la floraison (mutant insensible à la photopériode) : les mutants du gène Constans ; chez ces mutants, le gène Constans s’exprime tout le temps. Comment ce gène est-il exprimé au cours de la journée ? Certains gènes sont transcrits de façon très importante, beaucoup de protéines sont donc produites. D’autres gènes sont très peu transcrits, peu de protéines sont donc produites. Dans le même élément (cellule…), un gène peut être très fortement transcrit à un moment de la journée et très peu transcrit à un autre moment de la journée. Au niveau du northern blot : un gène fortement transcrit = une grosse tache, un gène faiblement transcrit = petite tache. Une sonde permettra de repérer l’ARNm de Constans.

Mesure du niveau d’expression (ARN) du gène Constans au cours de la journée 4

Comment l’expression cyclique de Constans est-elle contrôlée ? La cyclisation de l’expression de Constans est due à l’horloge ci rcadienne basée sur deux gènes : Lhy et Toc 1 : c’est un mécanisme auto-entraîné. La protéine Toc 1 est un facteur de transcription activateur qui va se fixer sur un promoteur de Lhy et activer sa transcription. Lhy est un facteur de transcription répresseur de Toc 1 : il se fixe sur son promoteur et empêche sa transcription. A un endroit du cycle, il n’y a plus de Toc 1 car il n’est plus transcrit, donc il n’y a plus de transcription de Lhy. Lhy n’est plus transcrit, donc il finit par disparaitre, il n’y a donc plus de facteur répresseur de Toc 1, donc la transcription de Toc 1 recommence et le cycle recommence. Les deux protéines (Toc 1 et Lhy) s’autorégulent. De plus Lhy et Toc 1 sont des facteurs de transcription des morning genes et des evening genes. Ex. : Lhy réprime les evening genes et Toc 1 active les evening genes. Constans est donc un evening gene.

(Modèle des coïncidences) On prévoit que la protéine Constans sera présente quand l’ARN est présent (la nuit) et qu’elle sera absente quand l’ARN est absent (le jour). On utilise donc le western blot pour détecter la protéine Constans grâce à l’utilisation d’anticorps. Il faut récupérer des feuilles à différentes heures, en extraire les protéines et faires différents échantillons (pour les différents heures), puis séparer les protéines par électrophorèse (celles qui vont le plus loin sont les plus petites ; celles qui vont le moins loin sont les plus grandes). Pour trouver la protéine Constans, on utilise un anticorps anti-Constans : la protéine Constans est injectée dans un animal (le lapin), ce qui engage une réponse immunitaire et une création d’anticorps anti-constans dans le sang de l’animal, puis on le saigne pour récupérer le sérum sanguin dans lequel se trouvent les anticorps. La prédiction ne colle pas avec l’observation. Légende : rond rouge = prévision juste : protéine effectivement présente ; rond rose = prévision fausse : on pensait que la protéine serait là mais elle n’est pas présente. Lorsque le jour est long, Constans est présent à certaines heures, cependant lorsque le jour est court, Constans n’est pratiquement jamais présent. 5

La différence entre jour court et jour long est le temps d’éclairement. La protéine Constans est bien produite quand il y a de l’ARN mais la protéine est tout de suite dégradée s’il fait nuit, contrairement à s’il fait jour où elle est conservée. Une plante peut donc savoir si elle est en été ou en hiver grâce au gène de Constans. Deux types de régulation sont exercées sur le gène Constans : - Transcriptionnelle au niveau de la production d’ARN ; - Post traductionnelle : la protéine Constans peut être dégradée ou conservée. Rôle de la lumière et de Constans dans la mesure de la durée de la nuit On pense que le phytochrome intervient dans la perception de la lumière. Jours longs : Constans présent  Arabidopsis thaliana va fleurir. Jours courts : Constans absent  Arabidopsis thaliana ne fleurit pas. Donc les plantes perçoivent la photopériode.

Le signal lumière est-il perçu par le méristème ? Le greffon a mené un signal permettant la floraison en période de jour court. La lumière est perçue au niveau des feuilles et pas du méristème apical. Le gène Constans est exprimé dans les cellules des feuilles, il est produit dans les feuilles : les feuilles perçoivent donc la photopériode. Un signal est donc produit pour porter l’information des feuilles jusqu’au méristème. Hypothèse : le messager est une hormone : le florigène.

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Le mutant FT « flowering locus T » Le mutant FT ne fleurit pas en condition de jour long. Le gène Constans est normal chez le mutant FT mais il n’y a quand même pas de floraison. Le gène Constans permet l’activation de FT qui permet la floraison. Lorsque FT est muté, il n’y a plus de floraison. Mutant FT  Constans normal  FT muté  pas de floraison. Sauvage  Constans normal  FT  floraison. Le gène Constans est un facteur de transcription de FT. FT est également exprimé dans les feuilles de la plante.

Mode d’action de FT (1) Greffe sauvage/FT : FT est produit dans la partie basale de la plante (qui vient d’une plante sauvage) et permet la floraison malgré que la plante ne soit pas entièrement sauvage : on peut donc dire que FT a migré jusqu’au méristème apical.

Mode d’action de FT (2) : localisation de la protéine FT dans le greffon Immunolocalisation : introduction d’anticorps dans les tissus d’un organisme pour localiser une protéine. Echantillon : couper l’apex, le tremper dans un bain fixateur pour fixer les éléments, faire une étape d’inclusion dans une résine pour rigidifier, puis faire des coupes très fines (5 à 10 micromètres), et placer les anticorps sur la coupe. Les cellules de l’apex vont accrocher l’anticorps et devenir fluorescentes par exemple (marquage au niveau de la partie noire). La protéine FT est présente dans le phloème (transport de la sève élaborée). La protéine FT prend le chemin du phloème pour monter jusqu’au méristème apical. FT est donc le fameux « florigène », mais c’est une protéine et pas une hormone.

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b) Le signal température : la vernalisation Arabidopsis thaliana est une plante bisannuelle : elle fleurit seulement une fois tous les deux ans. Arabidopsis – année 1

Arabidopsis – année 2

Année 1 Année 2

Stade de la plante Graine Rosette

Printemps Rosette Rosette

Eté Rosette Fleur (jour long)

Hiver Rosette Graine

Pourquoi la plante ne fleurit-elle pas la première année ? Une plante n’ayant pas subi un hiver froid ne va pas fleurir lors de l’été de l’année 2. Arabidopsis thaliana a besoin d’un hiver froid pour fleurir : elle a absolument besoin du froid de l’hiver. La vernalisation est une exposition à des températures froides (moins de 10 °C) pendant plusieurs semaines consécutives. S’il fallait peu de jours de froid à la plante pour déclencher la germination, elle germerait en plein hiver. Pour comprendre ce processus au niveau moléculaire, on utilise des mutants : les mutants FLC. Intervention de FLC dans le contrôle de la floraison Le mutant FLC fleurit à l’été de l’année 1 : c’est une plante annuelle. Il fleurit l’été, donc il est toujours capable de percevoir la photopériode : le signal photopériode est donc correct chez le mutant FLC. FLC sauvage est un répresseur de la floraison et permet à la plante de fleurir à l’été de l’année 2, mais FLC n’affecte pas le gène Constans. 8

Avant la vernalisation : FLC s’enroule autour des histones et va être transcrit et traduit. FLC est un facteur de transcription répresseur de FT, donc il n’y aura pas de floraison avant la vernalisation car il n’y aura pas de production de FT. Après la vernalisation : une série de protéines va être produite (VRN1, VRN2, VIN3), elles vont s’accrocher à l’ADN et compacter la chromatine de façon à ce que l’ARN polymérase n’ait plus accès à FLC et ne puisse plus le transcrire car il n’y a plus de fixation à son promoteur. FT peut donc être produit et la floraison se produit à l’été de l’année 2. Une régulation au niveau de la structure de l’ADN permet la vernalisation.

c) Les autres signaux 

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Les signaux endogènes : ce sont des signaux internes à la plante qui vont ordonner à la plante de fleurir ou non en fonction de son stade de développement. Ils interprètent le taux de réserves de la plante et ils répriment FLC lorsque la plante est assez évoluée. Les hormones végétales (phytohormones) : les gibbéréllines vont entrainer la floraison par l’activation de FT. Une plante en stress va produire de l’éthylène qui réprime les gibbéréllines et donc la floraison : le stress est répresseur de la floraison. L’ombrage : même si la photopériode est correcte, l’ombre va plus filtrer le rouge (rouge clair à 660 nm) dont la plante a besoin pour fleurir. La nutrition : la floraison va dépendre de la balance carbone-azote : -lorsqu’il y a beaucoup de carbone : la plante fleurit, -lorsqu’il y a beaucoup d’azote : la plante ne fleurit pas. FT est l’intégrateur de la floraison, tous les signaux relatifs à la floraison convergent vers lui : FT les intègre en fonction des facteurs fixés sur son promoteur

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2. La mise en place des pièces florales Les méristèmes floraux se forment proches de la hampe florale. Les bractées sont des petites feuilles situées sous les méristèmes floraux. Les verticilles floraux se forment à partir des primordiums floraux. Formation des verticilles floraux

a) Mise en place du méristème floral (gène d’identité du méristème floral) Pour étudier la mise en place du méristème floral, les scientifiques ont utilisé des mutants pour le gène leafy : ces mutants développent des tiges ornées de feuilles au lieu de développer des fleurs. On n’observe pas de méristème floral différencié chez les mutants leafy. On en déduit que le rôle du gène leafy sauvage est de permettre le développement d’un méristème floral. Leafy est un gène d’identité du méristème floral (activé par FT) : il fait donc parti de la famille des GIMF. 10

Leafy s’exprime dans les cellules qui vont se transformer en méristèmes floraux : FT active donc leafy dans des zones précises.

b) Mise en place des organes floraux (gènes ABC d’identité des organes floraux) Le méristème floral se transforme en fleur grâce à un autre groupe de gènes : les gènes d’identité des organes floraux (ABC).

Chez les mutants ABC on remarque que :  Le nombre de verticilles ne change pas ;  Il y a toujours deux verticilles touchés et modifiés ;  Il y a toujours deux pièces florales restantes. Le gène A permet la mise en place des sépales et des pétales. Le gène B permet la mise ne place des pétales et des étamines. Le gène C permet la mise en place des étamines et des carpelles. 11

Localisation des zones d’expression des gènes ABC Exemple d’un gène de classe B : le gène pistillata

Pour la localisation du gène pistillata de classe B, on utilise l’hybridation in situ : elle permet d’observer dans quelles cellules on trouve l’ARNm d’un certain gène, et donc dans quelles cellules ce gène est exprimé ; elle s’effectue de la manière suivante : tout d’abord, il y a récupération de matériel cellulaire, puis des coupes fines sont faites et enfin une sonde constituées d’acides nucléiques simple brin marqués est introduite dans les tissus. On constate qu’un signal commence à apparaitre sur l’image A, puis ce signal s’intensifie sur les images B et C, on remarque qu’il est présent au niveau des pétales et des étamines. L’expression du gène pistillata se situe au niveau des pétales et des étamines : les gènes de classe B permettent donc la mise en place des pétales et des étamines. Exemple d’un gène de classe C : le gène agamous Pour la localisation du gène agamous de classe C, on utilise des plantes transgéniques qu’on va transformer en intégrant une construction formée du promoteur du gène agamous associé à la séquence codante du gène Gus : la séquence codante du gène Gus remplace la séquence codante du gène agamous. Le gène Gus code pour la protéine β-Glucuronidase qui peut cliver le XGal : une coloration bleue apparait dans les cellules où le X-Gal a été clivé. La β-Glucuronidase va être produite uniquement dans les cellules où des facteurs de transcription se fixeront sur le promoteur : seulement dans les cellules où il y aura des facteurs de transcription du gène agamous. Ensuite il y a introduction de X-Gal dans les tissus pour obtenir la coloration bleue des zones étudiées. On observe que les cellules des étamines et des carpelles sont colorés en bleue. Donc agamous s’exprime dans les étamines et les carpelles : les gènes de classe C permettent la mise en place des étamines et des carpelles. Cette méthode était un autre moyen de visualisation de l’expression d’un gène. On dit que le gène Gus est un gène rapporteur : il rapporte l’expression du gène agamous.

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Sépales : A ; Pétales : A+B ; Etamines : C+B ; Carpelles : C.

Les protéines A, B et C sont des facteurs de transcription. La protéine A seule se fixe sur un promoteur des sépales. Les protéines A et B associées forment un complexe protéique et se fixent sur un promoteur des sépales. Les protéines B et C associées forment un complexe protéique et se fixent sur un promoteur des étamines. La protéine C seule se fixe sur un promoteur des carpelles. Il y a quatre familles de gènes différents pour quatre verticilles. Les gènes A, B et C ne sont pas eux-mêmes responsa...