Bioquimica I _ Practica Nº 12 Digestion _ UCSM Arequipa PDF

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PRACTICA Nº 12DIGESTIÓNRELACIÓN DE EXPERIMENTOS. Hidrólisis enzimática del almidón. Acción de la amilasa salival. Digestión de triglicéridos de la leche. Digestión de la ovoalbúmina. Acción de la pepsina y tripsina. OBJETIVOS. Conocer la manera cómo actúa la amilasa salival sobre el almidón Reconoce...

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PRACTICA Nº 12 DIGESTIÓN RELACIÓN DE EXPERIMENTOS. 1. Hidrólisis enzimática del almidón. Acción de la amilasa salival. 2. Digestión de triglicéridos de la leche. 3. Digestión de la ovoalbúmina. Acción de la pepsina y tripsina. OBJETIVOS. 1. Conocer la manera cómo actúa la amilasa salival sobre el almidón 2. Reconocer el requerimiento de sales biliares para una acción eficiente de la lipasa pancreática sobre los triglicéridos. 3. Evaluar la necesidad de condiciones óptimas de pH para la buena actividad de pepsina y tripsina para la degradación de proteínas. INTRODUCCIÓN. La digestión y absorción, son las etapas previas que deben experimentar los carbohidratos, lípidos y proteínas, que son los principales componentes de la dieta del hombre, para ser incorporados al organismo. De las sustancias que componen los alimentos, sólo, el agua, las sales inorgánicas, las vitaminas, algunos lípidos y monosacáridos pueden ser utilizados directamente por el organismo. La mayoría de los componentes que se ingieren en la dieta deben ser sometidos a un proceso de degradación que se conoce con el nombre de digestión. Durante este proceso las moléculas complejas presentes en los alimentos son descompuestas en sustancias más simples, que el organismo puede incorporar y utilizar. Esta degradación se cumple mediante reacciones de hidrólisis, catalizadas por enzimas presentes en los jugos digestivos. Cuando se obtienen por la digestión, moléculas sencillas, éstas ingresan a la circulación sanguínea mediante un proceso de absorción a nivel de la mucosa intestinal. Este proceso no es simplemente una difusión de sustancias de bajo peso molecular a través de las membranas celulares permeables, sino que éste es el resultado de un proceso selectivo.

Hidrólisis enzimática del almidón. El almidón es un hidrato de carbono ampliamente distribuido en las plantas, donde se encuentra constituyendo gránulos envueltos en una fina membrana de celulosa. Estos gránulos no son solubles en el agua, pero al romperse la pared de celulosa por trituración o por calentamiento, se libera el almidón soluble. Si la solución en caliente es muy concentrada, al enfriarse se transforma en un gel. El almidón es en realidad una mezcla de dos polisacáridos: Amilosa y amilopectina. La amilosa es un polímero lineal formado por moléculas de glucosa unidas por enlaces glicosídicos alfa 1 – 4. La amilopectina es un polímero ramificado constituido por moléculas de glucosa, que se unen por enlaces alfa 1 – 4 y alfa 1 – 6. La hidrólisis de los enlaces glicosídicos del almidón es catalizada por ácidos, así como por enzimas, dentro de estas últimas, podemos mencionar a la amilasa salival. La amilasa salival, es una endoamilasa que hidroliza los enlaces  1 – 4, presentes en el interior de la molécula del almidón, obteniéndose como productos fundamentalmente maltosa. Se producen además escasos residuos de maltotriosa, glucosa y unas estructuras ramificadas llamadas dextrinas límite, que presentan enlaces  1 – 6, los cuales no son hidrolizados por la amilasa salival. En la degradación del almidón por la amilasa salival se obtienen los siguientes intermediarios: Almidón

Almidón soluble

Dextrinas superiores +

Maltosa

+

Maltotriosa

Eritrodextrinas + Maltosa + Maltotriosa

Acrodextrinas + Maltosa + Maltotriosa

Maltosa + Glucosa en pequeña cantidad

El control de la degradación del almidón se realiza mediante las reacciones del yodo y del Benedict cualitativo; la primera es positiva para los polisacáridos, mientras que la segunda identifica al azúcar reductor que se forma.

EXPERIMENTO N°1. Hidrólisis del almidón por acción de la enzima amilasa -

Preparar 7 tubos como se detalla a continuación: Tubos

Almidón

Agua

Amilasa Maltosa

Desionizada 1

x

Buffer

Buffer

Buffer

pH 2

pH 7

pH 9

x

2

x

x

x

x

3*

x

x

x

4

x

x

x

5

x

x

6

x

x

7

x

x

x x x

*El tubo N°3 se pondrá en ebullición previo a la incubación.

-

Una vez preparados los tubos, se pondrán en incubación a 37°C durante 1 hora, pasado este tiempo se podrá evaluar la digestión mediante dos reacciones la de Benedict y la de Yodo.

EXPRESIÓN DE RESULTADOS:

Complete la tabla con los resultados obtenidos: Tubos

1

2

3

4

5

6

7

Test

+

-

+

-

-

+

+

-

-

-

++

++

+

+

Yodo Test Benedict

Figura Nº 12.1. Test de yodo para la hidrolisis del almidón por acción de la amilasa

Figura Nº 12.2. Test de Benedict para la hidrolisis del almidón por acción de la amilasa INTERROGANTES. 1. ¿Cuál fue el propósito de preparar el tubo 1 y 2? Son tubos “control” que tienen el propósito de hacer comparaciones con los tubos restantes. Por esa razón en el tubo 1 solo hay sustrato por lo que es positiva en presencia de yodo, y en el tubo 2 solo hay enzima y es negativa al yodo, debido a que no hay sustrato, no hay reacción. 2. ¿Qué se puede concluir de los tubos 3 y 4? El tubo 3 es positiva para el yodo y negativa para Benedict, debido a que el sustrato no ha sido catalizado por la enzima, debido a que el tubo previamente fue expuesto a ebullición, lo que hizo que la enzima se desnaturalizara y perdiera su acción biológica sobre el almidón. A diferencia del tubo 3, el tubo 4 no fue expuesto a ebullición por lo que la enzima sí pudo hidrolizar al almidón liberando unidades de glucosa, razón por la cual es negativo para el yodo y positivo para Benedict, ya que éste último reacciono con el carbono anomérico de la glucosa. 3. ¿Qué nos dice con respecto a la actividad de la amilasa los tubos 5,6 y 7? (pH) El tubo 5 es negativo para el yodo porque no hay almidón, y es positivo para Benedict porque pese a que no hay digestión, no hay enzima, la maltosa al estar compuesta por

dos glucosas, una de ellas va a tener el carbono anomérico libre y va ser capaz de reaccionar con el reactivo Benedict por lo que dará un color café rojizo. En el tubo 6, la enzima fue expuesta a un pH 2 (no optimo) afectando negativamente la acción biológica de la enzima, pues ésta no pudo hidrolizar al almidón, razón por la cual fue positiva para el yodo. Por otro lado, en el tubo 7 al igual que en el tubo 6 fue positivo para el yodo, porque se trabajó con un pH fuera del óptimo y no hubo hidrolisis del almidón. No obstante, con la prueba de Benedict fue ligeramente positivo, puesto que se observó una coloración verde, esto se debe a que en los extremos del almidón hay la presencia de carbonos anoméricos libres, pero son muy pocos. 4. ¿Cuál fue el pH óptimo para la amilasa? El pH óptimo para la amilasa a estas condiciones fue de 7, ya que es en este pH donde se logró la hidrolisis del almidón. 5. ¿La amilasa trabaja pH distintos al de su valor óptimo? Tal como se observó en la simulación, la amilasa no puede trabajar fuera de su pH óptimo, y si lo hace, la hidrolisis es muy lenta casi nula. 6. ¿Cuál es el producto final de la digestión del almidón? El producto final luego de la digestión del almidón son glucosas. 7. ¿En qué tubos se detectó la presencia de maltosa al final del experimento? En el tubo 4 y 5. Puesto que en el tubo 4, de acuerdo a los resultados, es negativo ante yodo y positivo con Benedict, lo cual indica que la enzima ha hidrolizado al almidón. Y como se trata de la amilasa salival, ésta solo rompe los enlaces alfa 1,4 del almidón entonces como productos de la hidrolisis se tendrá unidades de glucosa, maltosa, maltotriosa y alfa dextrina límite. En tubo 5 también se detectó la presencia de la maltosa, debido a que a éste tubo no se agregó amilasa salival, por lo que no hubo hidrolisis del sustrato inicial (maltosa). 8. ¿Por qué no hubo presencia de maltosa en otros tubos? No hubo maltosa en el resto de tubos, debido a que no se logró catalizar el almidón por las condiciones muy acidas o muy básicas, la falta de enzima y/o temperatura muy alta. 9. ¿La amilasa salival sería desactivada en el estómago? ¿Por qué? La amilasa salival sí es “desactivada” en el estómago debido al ácido pancreático, ya que este acido o jugo pancreático tiene un pH de 3.3. Esto es corroborado con la simulación que se realizó a pHs muy ácidos fuera del óptimo, la amilasa pierde su actividad biológica

ya que ésta tiene un pH neutro, por eso en presencia del jugo pancreático es totalmente inactivada. Hidrólisis enzimática de una proteína por acción de enzimas digestivas La pepsina es una enzima que tiene la capacidad de hidrolizar los enlaces peptídicos que conforman a las proteínas. Pepsina hidroliza enlaces peptídicos en los cuales participan los aminoácidos aromáticos y leucina y que aportan el grupo amino para formar el enlace peptídico. El sustrato utilizado para estudiar esta enzima será BAPNA, una proteína sintética. EXPERIMENTO N°2. Evaluación de la actividad enzimática de la pepsina frente a BAPNA. La proteína es incolora, pero al ser digerida, producirá una coloración amarilla -

Preparar 7 tubos de acuerdo a lo indicado en la siguiente tabla:

Tubos

Pepsina

BAPNA

Agua

Buffer

Buffer

Buffer

desionizada

pH 2

pH 7

pH 9

1*

x

x

x

2

x

x

x

3

x

4

x

5

x

x

6

x

x

x

x

x

x x x

*Hervir el tubo N°1, previo a la incubación. -

Incubar en el baño María a 37°C durante 1 hora.

-

Se evaluará la digestión midiendo la densidad óptica de cada tubo utilizando un espectrofotómetro.

Figura Nº 12.3. Actividad enzimática de la pepsina frente a BAPNA

EXPRESIÓN DE RESULTADOS: -

Anotar los resultados obtenidos en la siguiente tabla: Tubos Densidad óptica

1

2

3

4

5

6

0.00

0.40

0.00

0.00

0.03

0.00

INTERROGANTES. 1. ¿Cuál es el pH donde se obtiene la mayor hidrólisis de la proteína BAPNA? La mayor hidrolisis de la proteína BAPNA se da en el pH 2. 2. ¿Qué efecto tiene la ebullición sobre la actividad enzimática? ¿Con cuál tubo llegó a esa conclusión? La ebullición hace que la enzima se desnaturalice, perdiendo su actividad biológica sobre su sustrato. Por esa razón en el tubo 1, no hay actividad enzimática, no hay digestión del sustrato BAPNA. 3. ¿Congelar el tubo tendría el mismo efecto? Probablemente sí, porque al congelar el tubo, la reacción disminuiría o incluso se detendría, ya que cambiaría de estado (líquido a solido) decreciendo la cinética molecular, sin embargo la acción catalítica regresaría en cuanto el tubo sea expuesto a la temperatura óptima de la enzima, lo cual no sucede cuando la enzima es expuesta a ebullición. 4. ¿Cuáles son los tubos controles? ¿Qué controlan? Los tubos controles son el tubo 3 y 4, no controlan algo en específico pero sí están están diseñados para realizar comparaciones con el resto de muestras o tubos y observar que variaciones hubo con respecto a éste. Digestión de los triglicéridos de un aceite vegetal. Los lípidos se caracterizan por ser insolubles en el agua, lo cual constituye un problema para la digestión, ya que los sustratos no son fácilmente accesibles a las enzimas digestivas de la fase acuosa. Además, si los lípidos ingeridos se hidrolizan en constituyentes más simples, estos tienden a agregarse en complejos mayores, lo cual dificulta su absorción. Estos problemas se pueden superar mediante el aumento del área lipídica y por solubilización de los productos de hidrólisis con detergentes.

La digestión de las grasas, en el organismo ocurre por acción de las lipasas, las cuales requieren de un agente solubilizante, las sales biliares y de una proteína la colipasa que permite la interacción de la lipasa con los triglicéridos que se encuentran en la parte interna de la micela. La digestión de los Triglicéridos da como resultado:  - monoglicéridos, diglicéridos y ácidos grasos, éstos últimos pueden ser determinados por titulación con hidróxido de sodio. EXPERIMENTO N°3. Acción de la lipasa sobre un aceite vegetal. -

Preparar 7 tubos de acuerdo a la siguiente tabla: Tubos

Lipasa

Aceite

Sales

Buffer

Buffer

Buffer

Agua

vegetal

biliares

pH 2

pH 7

pH 9

desionizada

1*

x

x

x

x

2

x

x

x

x

3

x

x

4

x

x x

5

x

x

6

x

x

x

7

x

x

x

x x

x

x

x

x x

*Hervir tubo N°1 previo a la incubación.

-

Incubar a 37°C durante 1 hora en el baño María.

-

Evaluar la acción de la lipasa mediante las variaciones de pH en cada tubo al final de la incubación, para esto se medirá el pH utilizando un pHmetro.

EXPRESIÓN DE RESULTADOS: -

Anotar los resultados obtenidos en el siguiente cuadro: Tubos

1

2

3

4

5

6

7

pH

7

6.21

6.72

9

7

2

8.97

Figura Nº 12.4. Acción de la lipasa sobre un aceite vegetal.

INTERROGANTES. 1. ¿Qué mostró el tubo N° 1? En el tubo no se mostró acción enzimática (no digestión de lípidos), debido a que éste fue expuesto a ebullición inactivando así la acción catalítica de la enzima. 2. ¿Por qué el tubo N°1 tuvo un pH final de 7? Porque la enzima fue inactivada cuando fue expuesta a ebullición, razón por la cual no se observó cambios en el pH. 3. ¿Cuál es la principal diferencia entre el tubo N°2 y 3? La principal diferencia es que en el tubo 3 no hay la presencia de sales biliares, las cuales son necesarias para emulsificar a los triacilgliceridos de cadena larga. 4. ¿Qué acción tienen las sales biliares? Las sales biliares actúan como detergentes, disminuyen la tensión superficial haciendo emulsionar a las grasas para favorecer la formación de micelas. 5. ¿Se podría decir que ocurrió la hidrólisis de grasas en el tubo N°5? ¿Por qué? No, porque no se agregó la enzima lipasa, quien es la encargada de hidrolizar los triglicéridos. 6. ¿Qué efecto tuvo el uso de los buffers en el proceso digestivo? El efecto del uso de diferentes buffer fue observar la hidrolisis de la lipasa e identificar el pH óptimo en el cual la enzima lipasa hidroliza ala grasa. Mientras más acido sea el Buffer menor liberación de ácidos grasos ya el medio estará fuera del óptimo de la enzima. 7. ¿Cuáles son los productos finales de la digestión en el tubo N° 2? Los productos finales de la digestión de lípidos en este tubo fueron los ácidos grasos y glicerol.

8. ¿En cuales tubos se pudo detectar la presencia de ácidos grasos? En los tubos 2 y 3, pero a diferencia del tubo 2, los ácidos grasos del tubo 3 fueron de cadena corta debido a que la ausencia de sales biliares y en el tubo 2 de cadena larga....