Practica de bioquimica I PDF

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Hidrolisis de carbohidratos...

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ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA: QUÍMICA

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUÍMICA I Práctica No.2 DATOS GENERALES: NOMBRES: Camino Camila González Myriam Toaquiza Valeria

CODIGOS: 302 200 424

GRUPOS No. 1 FECHA DE REALIZACIÓN: 03/06/2020

FECHA DE ENTREGA: 11/06/2020

TEMA: REACCIONES DE IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS 1. OBJETIVOS: 2.1. GENERAL Identificar cualitativamente la presencia de carbohidratos en algunas disoluciones (glucosa, fructosa, lactosa, xilosa) mediante el ensayo de diferentes pruebas químicas (Molish, Barfoed, Seliwanoff y Bial) para diferenciar su composición y estructura.

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2.2. ESPECÍFICOS Verificar mediante la prueba de Molish si las soluciones presentes son carbohidratos. Identificar mediante la prueba de Barfoed si las soluciones de carbohidratos al 5% son azúcares reductores. Analizar si las soluciones presentes son pentosas o hexosas mediante la aplicación de la prueba de Bial. Determinar mediante la prueba de Seliwanoff, a que familia de carbohidratos (cetosas, aldosas) pertenecen las diferentes soluciones. 2. MARCO TEÓRICO

• Carbohidratos. Son compuestos polihidroxilados con grupo aldólico o cetónico (fórmula general (CH2O)n). (1) Los carbohidratos pueden dividirse en 4 grandes grupos: polisacáridos, oligosacáridos, disacáridos y monosacáridos. En la práctica sólo no centramos en: Disacáridos: formados por dos monosacáridos unidos por un enlace glicosídico, al igual que los monosacáridos son altamente solubles en agua. Los principales disacáridos son sacarosa, lactosa y maltosa. Monosacárido: Son la unidad fundamental de todos los carbohidratos, son la forma más simple de un azúcar, siendo los principales monosacáridos la glucosa, fructosa, y galactosa (1) • Diferencia entre un azúcar reductor y no reductor. Los azúcares según su comportamiento químico pueden ser: reductores o no reductores. Los azúcares reductores cíclicos poseen al menos un grupo hidroxilo libre del carbono anomérico, el cual es susceptible de mayor oxidación. Los azúcares no reductores no tienen este grupo hidroxilo por lo que no pueden actuar como reductores.(2) Los azúcares reductores pueden ser oxidados por agentes oxidantes débiles. En medio acuoso, los azúcares reductores generan uno o más compuestos que contienen un grupo aldehído. Esta propiedad permite determinar la concentración de una disolución de azúcar midiendo la cantidad de agente oxidante que es reducido.(3) • Marcha analítica para análisis de carbohidratos: La marcha analítica es una serie de pruebas cualitativas para identificar carbohidratos y sus estructuras. A continuación, se muestran las pruebas y sus reacciones se especifican en la sección 6.1 del informe: Reacción de Molisch: la prueba es coloreada, se basa en la acción hidrolizante y deshidratante del H2SO4© sobre los carbohidratos. En esta prueba el ácido fuerte cataliza la hidrólisis de cualquier enlace glucosídico presente en la muestra y la deshidratación de los monosacáridos resultantes para formar furfural (pentosas) o hidroximetilfurfural (hexosas). Estos furfurales se condensan con el alfa-naftol del Reactivo de Molish, y originan un producto de color violeta. Esta prueba sirve para identificar carbohidratos (azúcares en general).(4) El reactivo de Barfoed: Es coloreada, se usa para identifica carbohidratos mono o disacárido y es de especial interés saber si es un azúcar reductor o no. Los monosacáridos reducen rápidamente (2 minutos) el reactivo de Barfoed a Cu +, el cual precipita como Cu2O de color rojo en solución de ácido débil. En cambio, los disacáridos reducen el Cu2+ en más tiempo (7-12 minutos). (4) Cuando se identifica que es un monosacárido reductor se pueden aplicar dos pruebas para saber si se trata de una hexosa o pentosa, y si es una aldosa o cetosa. Ensayo de Bial: reacción coloreada y específica para pentosas y ciertos ácidos irónicos que se descomponen al calentarse con ácidos fuertes formando pentosas Bajo condiciones controladas de temperatura, tiempo y concentraciones de HCl, las pentosas son sápidamente convertidas en furfural, mientras que el hidroximetilfurfural se genera a partir de las hexosas presentes. En presencia de ion férrico (Fe3+) y orcinol (5-metil resorcinol), el furfural se condensa rápidamente para producir un complejo verde al calentar.(4) Ensayo de Seliwanoff: es una reacción coloreada, permite identificar cetosas. En solución de HCl©, las cetosas son deshidratadas más rápidamente que las aldosas produciendo derivados del furfural. Estos compuestos forman complejos con el resorcinol presente en el reactivo de Seliwanoff, produciendo un color rojo cereza. En las

condiciones en las que se efectúa el ensayo, todas las cetosas que puedan esta unidas por enlaces glucosídicos, quedarán en libertad y darán una reacción positiva.(4) • Carbohidratos en análisis: Xilosa: Monosacárido de 5 carbonos, tiene un grupo funcional aldehído, por lo que se clasifica como una aldopentosa. Este carbohidrato posee cuatro grupos OH y gracias a su grupo aldehído libre, es considerado un azúcar reductor. La forma o el isómero más común en la naturaleza es la D-xilosa. (5)

Ilustración 1: Proyección de Fisher para laD- y L-Xilosa (Fuente: akane700 [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)]

Fructosa: Monosacárido e isómero de la glucosa C6H12O6. Es una cetohexosa (6 átomos de carbono y un grupo cetona), es un glúcido reductor, es levógira y tiene 3 carbonos asimétricos. En disolución se encuentra predominantemente en la forma β-piranosa y en la forma β-furanosa. Se encuentra en forma abundante en las frutas, pero también la encontramos en verduras. (5)

Ilustración 2: Estructura química de la fructosa, Recuperado de: Garrett, R.,. Biochemistry (4th ed.).

Glucosa: Carbohidrato o glúcido monosacárido con fórmula estructural C6H12O6. Es una aldohexosa (6 átomos de carbono y un grupo aldehído), tiene 2 enantiómeros, aunque la D-glucosa es predominante en la naturaleza Es el constituyente básico de diversos polímeros de gran importancia biológica (polisacáridos de reserva: almidón y glucógeno y los estructurales: celulosa y quitina). (6)

Ilustración 3: Estructura química de la glucosa, Recuperado de (Maleszka, R. 1981)

Lactosa: Disacárido formado por los monosacáridos D-glucosa y D-galactosa unidos por un enlace β-glicosídico entre el C1 de la galactosa y el C4 de la glucosa, su fórmula es

C12H22O11. La lactosa es un azúcar reductor, debido a que posee el hidroxilo hemiacetálico, por lo que permite la reacción de Benedict1 y exhibe mutorrotación. (7)

Ilustración 4: Estructura química de la lactosa. Recuperado de: https://lactosa.org/wp-content/uploads/2017/02/ES-2016.pdf

3. MATERIALES Y REACTIVOS

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3.1. MATERIALES Gradilla para tubos Tubos de ensayo Pyrex (12) Placa calefactora Vaso de precipitados de 250 ml 3.2. REACTIVOS Reactivo de Molisch (sol al 5% de α-naftol en alcohol) Ácido sulfúrico concentrado Reactivo de Barfoed Reactivo de Seliwanoff Reactivo de Bial (orcinol)

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Pipetas graduadas de 10ml (3) Pinzas para tubos Pera

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Disoluciones de carbohidrato: - Glucosa 5% - Fructosa 5% - Lactosa 5% - Xilosa 5%

4. GRÁFICO Ilustración 1. Gráfico del equipo

Fuente 1. Camino C., González M. & Toaquiza V (9/6/2020)

5. PROCEDIMIENTO •

PRUEBA DE MOLISH

Ilustración 5 Procedimiento de la prueba de Molish. Fuente Camino C., Gonzáles M. & Toaquiza V. 9/6/2020

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PRUEBA DE BARFOED

Ilustración 6 Procedimiento de la Prueba de Barfoed. Fuente: Camino C., Gonzáles M. & Toaquiza V. 9/6/2020

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PRUEBA DE BIAL

Ilustración 7 Procedimiento de la Prueba de Bial. Fuente: Camino C., Gonzáles M. & Toaquiza V. 9/6/2020

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PRUEBA DE SELIWANOFF

Ilustración 8 Procedimiento de la Prueba de Seliwanoff. Fuente: Camino C., Gonzáles M. & Toaquiza V. 9/6/2020

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MARCHA ANALÍTICA PARA ANÁLISIS DE CARBOHIDRATOS

Ilustración 9 Marcha analítica para el reconocimiento de carbohidratos. Fuente: Camino C., Gonzáles M. & Toaquiza V. 9/6/2020

6. CÁLCULOS REACCIONES Y RESULTADOS 6.1. REACCIONES Reacción 6.1.1. Deshidratación de una hexosa

Fuente 2. Espinoza M (s.f) Propiedades y reactividad química de biomoléculas

Reacción 6.1.2. Deshidratación de una pentosa

Fuente 3. . Espinoza M (s.f) Propiedades y reactividad química de biomoléculas

Reacción 6.1.3. Hidrólisis de la Lactosa

Fuente 4 Aguiar, Carrillo, Díaz, Parreño, Vallejo (2014) Azúcares Rectores. Recuperado de https://sites.google.com/site/laboratoriosbioquimica/bioquimica-i/carbohidratos/hidrolisis-de-la-sacarosa

Reacción 6.1.4 . Reacción General de Molish con un carbohidrato

Fuente 5. Espinoza M (s.f) Propiedades y reactividad química de biomoléculas

Reacción 6.1.5. Reacción general de Barfoed con un monosacárido reductor

Fuente 6. Práctica XI (2010) Reacciones de carbohidratos. Recuperado de http://organica1.org/lab2/135.htm

Reacción 6.1.6. Reacción general de Seliwanoff

Fuente 7. Espinoza M (s.f) Propiedades y reactividad química de biomoléculas

Reacción 6.1.7. Reacción del Test de Bial

Fuente 8. Espinoza M (s.f) Propiedades y reactividad química de biomoléculas

6.2. RESULTADOS Reactivo de Molish Carbohidrato

No carbohidrato

Glucosa

Reactivo de Barfoed Azúcar reductor

Azúcar no reductor

Test de Bial Hexosas

Pentosas

Reactivo de Seliwanoff Cetosas

Aldosas

monosacárido

monosacárido Fructosa disacárido Lactosa ---monosacárido Xilosa -Tabla 1 Resultados de las diferentes pruebas cualitativas para identificar carbohidratos. Fuente Camino C., Gonzáles M. & Toaquiza V. 9/6/2020

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7. OBSERVACIONES

Ilustración 10: Resultados observados en la práctica. Realizado por: Camino, Gonzàlez, Toaquiza, 5/06/2020

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En las reacciones con el reactivo de Molish se observa un cambio de coloración a pardo negruzco de las cuatro muestras en análisis. Utilizando el Reactivo de Barfoed se observa un precipitado rojo al transcurrir el tiempo, el precipitado aparece primero para glucosa, fructosa y xilosa y demora un poco más para la lactosa. En el Test de Bial, se observa que se ha producido dos coloraciones diferentes, pardo para glucosa y fructosa y verde para la xilosa. Con el reactivo de Seliwanoff se observa la presencia de un precipitado rojo

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conforme se va enfriando la muestra, pero este precipitado únicamente aparece en la fructosa. Todas las reacciones necesitan la presencia de un ácido fuerte concentrado a excepción de la prueba de Barfoed.

8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS A partir de los resultados obtenidos (mostrados en la Tabla 1) podemos afirmar que todas las muestras con las que se trabajó (glucosa, fructosa, lactosa y xilosa) corresponden a carbohidratos, que experimentalmente dieron positivo para la prueba de Molish; en la que cada carbohidrato se deshidrata o hidroliza, según sea un monosacárido o disacárido respectivamente (reacciones 6.1.1, 6.1.2 y 6.1.3), para condensarse con el alfa-naftol del Reactivo de Molish (reacción 6.1.4); la coloración final resultó ser un pardo oscuro que afirma la presencia de azúcares según lo señala Nelson en su libro Principios de Bioquímica. (8) Seguidamente el reactivo de Barfoed, fue la única prueba que no necesitó hidrolisis para realizarse, Holde explica que esto se debe a que Barfoed es una reacción de óxidoreducción (reacción 6.1.5) con la presencia de iones Cu que se reducen; todas las muestras de carbohidratos dieron positivo para esta, debido a que tanto el disacárido lactosa, como los monosacáridos, glucosa, fructosa y xilosa, poseen el hidroxilo del carbono anomérico libre, susceptible a mayor oxidación; formando un precipitado correspondiente al óxido de cobre igualando la reacción(9)(10) El reactivo de Seliwanoff, únicamente reaccionó con la fructosa ( reacción 6.1.6), dando una coloración rojiza; esto se debe a que, de las cuatro muestras, únicamente la fructosa contiene un grupo carbonilo de cetona (11), y el reactivo de Seliwanoff que es una disolución de guayacol en medio ácido (ácido clorhídrico), hidroliza la fructosa a HMF (reacción 6.1.1) y forma un complejo con el resorcinol presente en el reactivo de Seliwanoff (8), produciendo un color rojo como el observado en la práctica. Finalmente, el test de Bial, que es una disolución de orcinol (100mg de FeCl3. 6H2O/100 ml de HClconc + 3,5 ml de orcinol al 6% en alcohol(12)) produjo dos coloraciones, verde para la xilosa ( reacción 6.1.7), y pardo para la glucosa y fructosa, incluida la lactosa, que debido a la presencia del medio ácido se hidrolizará según la reacción 6.1.3 y sus productos reaccionarán con el orcinol dando la coloración pardo antes mencionada(9). Como se observa en las reacciones, es el grupo carboxílico, del furfural o HMF que reaccionó con el principio activo de cada uno de los test, a excepción de la prueba de Barfoed, el cual correspondió a una reacción de óxido reducción. 9. CONCLUSIONES • Se identificó cualitativamente la presencia de carbohidratos en algunas disoluciones (glucosa, fructosa, lactosa, xilosa) y mediante el ensayo de diferentes pruebas químicas (Molish, Barfoed, Seliwanoff y Bial) se diferenció su composición y estructura. Así la glucosa es un carbohidrato, monosacárido y es una aldohexosa. La fructosa es un carbohidrato, monosacárido y es una cetohexosa. La lactosa es un carbohidrato disacárido y la xilosa es un carbohidrato, monosacárido y es una pentosa. •

Se verificó mediante la prueba de Molish que las soluciones presentes (glucosa, fructosa, lactosa y xilosa) eran carbohidratos, ya que todas formaron un

precipitado color rojo púrpura. •

Se identificó mediante la prueba de Barfoed que las soluciones de carbohidratos al 5% eran azúcares reductores, además se diferenció de acuerdo a la velocidad de reacción entre monosacáridos reductores (glucosa, fructosa y xilosa) que son más rápidas de los disacáridos reductores (lactosa) que son más lentos.

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Se analizó (después de haber identificado a los monosacáridos reductores) mediante la prueba de Bial la presencia de pentosas (xilosa), el cual tomó una coloración verde, mientras que las soluciones que tomaron una coloración parda oscura fueron hexosas (glucosa y fructosa)

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Se determinó mediante la prueba de Seliwanoff, la diferencia entre aldosas y cetosas en las soluciones que tenían hexosas. Se diferenciaron debido a que las cetosas (fructosa) reaccionan más rápido y tienen color rojo intenso, mientras que las aldosas (glucosa) reaccionan más lento y su color es rosa.

10. RECOMENDACIONES • Etiquetar los distintos tubos de ensayo para evitar confusiones, además tener todo el material previamente lavado y seco. • Tener precaución con la utilización de los ácidos, para introducirlo en los tubos de ensayo, se necesita colocarlos por las paredes del tubo. • Calentar los tubos de ensayo por el tiempo indicado para cada prueba, y no tomar los resultados pasado este tiempo, ya que puede conducir a errores. • En la prueba de Seliwanoff, es necesario llegar a la ebullición del agua de baño maría, al contrario de las demás pruebas en donde una temperatura entre 60-80°C es óptimo para que se realice la prueba. • No agitar a ninguna de las soluciones, porque esto puede provocar que sea difícil observar si se ha formado precipitado. • En la prueba de Bial, se necesita primero calentar el reactivo de orcinol antes de realizar el test correspondiente. • En la marcha analítica de reconocimiento de carbohidratos es mejor seguir el orden de pruebas de la siguiente forma: Prueba de Molish, Prueba de Barfoed, Prueba de Bial y Prueba de Seliwanoff • Se puede realizar estos mismos test para más soluciones a fin de identificarlos como carbohidratos, y seguir una marcha analítica para determinar algunas de sus propiedades, como por ejemplo si posee un grupo cetónico o aldehídico, si es un azúcar reductor o no, si es mono o disacárido. 11. CUESTIONARIO 1) Defina el fundamento de la prueba de Molish La reacción de Molish es un método cualitativo que permite observar la presencia de carbohidratos en una muestra desconocida. Se basa en la hidrolización de los enlaces glicosídicos para dar monosacáridos, para posteriormente ser deshidratados dando furfural y sus derivados, estos productos luego se combinan con α-Naftol Sulfonato originando un complejo púrpura. (1)(4) Todos los glúcidos por acción del ácido sulfúrico concentrado se deshidratan formando

compuestos furfúricos (las pentosas dan furfural y las hexosas dan hidroximetilfurfural). Estos furfurales se condensan con el reactivo de Molish (solución alcohólica de alfanaftol), dando un producto violeta. (3). La reacción de Molish se muestra en la sección 6.1.4. 2) Defina el fundamento de la prueba de Barfoed La Prueba de Barfoed es un ensayo químico cualitativo para identificar azúcares reductores. El ensayo se basa en una reacción de óxido reducción en la que los monosacáridos reducen al cobre pasando de Cu2+ a Cu+, es decir, se basa en la capacidad de reducción del ion cobre que precipita en forma de óxido de cobre (I) de color rojo ladrillo en presencia de azúcares reductores. De acuerdo a la velocidad de reacción permite distinguir monosacáridos reductores (reacción rápida) de disacáridos reductores (reacción lenta). (13) La reacción de Barfoed se muestra en la sección 6.1.5. 3) Defina el fundamento de la prueba de Seliwanoff Esta prueba química se usa para identificar cetosas. En solución de HCl©, las cetosas son deshidratadas más rápidamente que las aldosas produciendo derivados del furfural. Estos compuestos forman complejos con el resorcinol presente en el reactivo de Seliwanoff, produciendo un color rojo cereza. Es posible que las aldosas reaccionen produciendo un leve color rosa, por ello se puede usar esta prueba para identificar también aldosas y se diferenciarían cetosas de adosas de acuerdo al tiempo de reacción que empleen y por su coloración. (13) La reacción de Seliwanoff se muestra en la sección 6.1.6. 4) Defina el fundamento de la prueba de Bial La prueba de Bial es una reacción coloreada específica para pentosas y ciertos ácidos urónicos que se descomponen al calentarse, con ácidos fuertes formando pentosas. Bajo condiciones cuidadosamente controladas de temperatura, tiempo y concentraciones de HCl, las pentosas son rápidamente convertidas a furfural, mientras que el hidroximetilfurfural se genera a partir de las hexosas presentes. En presencia del ión férrico (Fe3+) y orcinol (5-metilrresorcinol), el furfural se condensa rápidamente para producir un complejo de color verde al calentar. (9) La reacción de Bial se muestra en la sección 6.1.7. 12. BIBLIOGRAFÍA 1.

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Tatiana Alejandra HN. Unidad Didáctica para la Identificacion Cualitativa Estrategia de aulas para la Construcción de las Loncheras Saludables. 2016;173:67. Lehninger. Principios de Bioquímica. 4th Edicio. Nelson D. y Cox M, editor. Editorial Omega; 2005. Murray KR et al. Bioquímica de Harper. 16a Ed. Editorial el Manual Moderno., editor. México; 2012. Roca P, Oliver J, Rodríguez A. Bioquímica, técnicas y métodos. Book of Chemical Information. 2003. 1–347 p. Kornguth ML, Hutchins G, Eichelman BS. La fructosa. 2010;30(17):165–86. Mathews C. Biochemistry. 3th ed. Pearson., editor. San Francisco, California:; 2000. 5–7 p.

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