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FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICAPRACTICA N° 8TEMA: DIGESTION ENZIMATICA DEL ALMIDONCURSO: BIOQUIMICADOCENTE: Q. ENRIQUE LEON MEJIATURNO: MAÑANACICLO: VIALUMNOS: DE LA ROCA CONTRERAS JOSE MASGO HIDALGO RUTHFECHA DE ENTREGA: 2/10/2018-IIDIGESTION ENZIMATICA DEL ALMIDONI) INTRODUCCIÓNLa cinética enz...

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FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA PRACTICA N° 8 TEMA: DIGESTION ENZIMATICA DEL ALMIDON

CURSO:

BIOQUIMICA

DOCENTE: Q.F. ENRIQUE LEON MEJIA

TURNO: MAÑANA

CICLO: VI ALUMNOS:  DE LA ROCA CONTRERAS JOSE  MASGO HIDALGO RUTH FECHA DE ENTREGA: 2/10/2018

2018-II

DIGESTION ENZIMATICA DEL ALMIDON I)

INTRODUCCIÓN

La cinética enzimática estudia la velocidad

de

las

reacciones

químicas que son catalizadas por las enzimas. El estudio de la cinética y de la dinámica química de una enzima permite explicar los detalles de su mecanismo catalítico,

su

papel

en

el

metabolismo, cómo es controlada su actividad en la célula y cómo puede ser inhibida su actividad por

fármacos

potenciada

por

o

venenos otro

tipo

o de

moléculas. Las enzimas, en su mayoría, son proteínas con la capacidad de manipular otras moléculas sin ser alterados por la reacción, esas moléculas son denominadas sustratos. Un sustrato es capaz de unirse al sitio activo de la enzima que lo reconozca y transformarse en un producto a lo largo de una serie de pasos denominados mecanismo enzimático. Algunas enzimas pueden unir varios sustratos diferentes y/o liberar diversos productos, como es el caso de las proteasas al romper una proteína en dos polipéptidos. En otros casos, se produce la unión simultánea de dos sustratos, como en el caso del ADN polimerasa, que es capaz de incorporar un nucleótido (sustrato 1) a una hebra de ADN (sustrato 2). Aunque todos estos mecanismos suelen seguir una compleja serie de pasos, también suelen presentar una etapa limitante que determina la velocidad final de toda la reacción. Esta etapa limitante puede consistir en una reacción química o en un cambio conformacional de la enzima o del sustrato.

II)

MARCO TEÓRICO

La reacción química catalizada por una enzima utiliza la misma cantidad de sustrato y genera la misma cantidad de producto que una reacción no catalizada. Al igual que ocurre en otros tipos de catálisis, las enzimas no alteran en absoluto el equilibrio de la reacción entre sustrato y producto. La eficiencia de la reacción, hasta el momento en que todos los sitios posibles estén ocupados. En ese momento se habrá alcanzado el punto de saturación de la enzima y, aunque se añada más sustrato, no aumentará más la eficiencia de la misma.

Un ensayo enzimático es un procedimiento, llevado a cabo en un laboratorio, mediante el cual se puede medir la velocidad de una reacción enzimática. Como las enzimas no se consumen en la reacción que catalizan, los ensayos enzimáticos suelen medir los cambios experimentados bien en la concentración de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentración de producto (que va aumentando). Existen diversos métodos para realizar estas medidas. La espectrofotometría permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (según la concentración de estos) y la radiometría

implica incorporación o liberación de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotométricos son los más utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reacción de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiométricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimática. También se puede utilizar la espectrometría de masas para detectar la incorporación o liberación de isótopos estables cuando el sustrato es convertido en producto. Actualmente existen métodos sencillos que se pueden emplear con alumnos de bachillerato como el propuesto por Johnson R.J. y colaboradores, quienes emplean hidrolasas de serina y un sustrato fluorogénico. Este método es rápido, sensible y permite medir la cinética enzimática, a través de la generación de fluoresceína como producto.

Los ensayos enzimáticos más sensibles utilizan láseres dirigidos a través de un microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reacción. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo

de catálisis o bien unir moléculas fluorescentes en lugares específicos de la enzima, que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catálisis.5 Estos estudios están dando una nueva visión de la cinética y la dinámica de las moléculas individuales, en oposición a los estudios de cinética enzimática tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una población de millones de moléculas de enzima. Uno de los objetivos más importantes en los estudios de la cinética enzimática es determinar el mecanismo químico que subyace en la reacción enzimática, por ejemplo, determinar la secuencia ordenada de sucesos que transcurren en la transformación de sustrato en producto. Las aproximaciones cinéticas discutidas anteriormente pueden proporcionar información relacionada con la velocidad de reacción de los intermediarios enzimáticos formados, pero no permitirán identificar qué intermediarios son exactamente.

III)

PARTE EXPERIMENTAL

Materiales       

Tubos de ensayo Placa de porcelana excavada. B.M. a 37ºC. Baño de hielo. Pipetas de 1 y 10 mL. Gradillas. Pinzas para tubo

Reactivos  Almidon 1% en regulador de fosfatos 0.02M  Glucógeno 1% en regulador de fosfatos 0.02M  Solución de lugol  Solución de NaCl 0.5N  Solución de amilasa pancreática al 1% o amilasa salival PROCEDIMIENTO

Colocar en una gradilla 7 tubos de prueba y colocar lo siguiente

TUBO

1

2

3

4

5

6

7

Almidón 1% (ml)

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

0

0

0

Agua destilada

0

0

0

0

1 ml

1 ml

1 ml

Pre incubación

Dejar 37°C por 5 minutos (se agrega Lugol)

Enzima pancreatina al 1%

Sin diluir

Dil. 1:5 0.5

Dil. Dil. Dil. 1:5 1:10 0.5 1:20 0.5 0.5

Dil. Dil. 1:10 0.5 1:20 0.5

NaCl 5%

1 gota

1 gota

1 gota

1 gota

Incubación

1 gota

1 gota

Dejar 37°C

Preincubamos por 5 minutos a 37°C

Después le agregamos 0.5ml de la enzima pancreatina más una gota de NaCl

1 gota

Volvemos a incubar 37°C por 2 minutos.

Después de 2 minutos

Después de incubar por 4 minutos logramos observar que el tubo 5 se tornó a un color más oscuro que el tubo 4.

Después de 6 minutos observamos que los tubos comenzaron a cambiar de color

Después de 8 minutos observamos que los tubos comenzaron a tornar a un color más claro

Después de 10 minutos observamos que los tubos comenzaron a cambiar de color

IV)

RESULTADOS



Se pudo identificar la actividad de la enzima amilasa sobre el sustrato (almidón).



Se verifico que a medida que aparece el producto desaparece el sustrato.



La pancreatina contiene una enzima llamada amilasa que actúa sobre el almidón y lo descompone en maltosa. Si el color es morado intenso, es que el Lugol ha reaccionado con el almidón, o sea no se ha descompuesto, pero si el color que toma es el naranja u amarillo significa que ya no hay almidón, sino maltosa; ya que se conserva el color característico del Lugol. La coloración se debe a que el Yodo ocupa los espacios vacíos en las moléculas de maltosa.

V) 

 

VI) 

DISCUSION Es importante tomar en cuenta varios factores que afecta la actividad enzimática y darle las condiciones óptimas para que la actividad se de en la mejor velocidad de reacción. Tenemos que darle una buena condición de T° a 37 ° (temperatura corporal). Definición teórica para calcular las unidades amiloliticas:

CONCLUSIONES

Se pudo demostrar la actividad enzimática en la amilasa (sustrato: almidón), a partir de tinción de Lugol.



El medio salino es uno de los principales factores para la actividad enzimática.



El conteo de unidades enzimáticas resulta de importancia al momento de saber la velocidad de acción.



El factor de pH en una enzima es uno de los factores mas importantes con respecto a la actividad enzimática (La amilasa necesita estar en un medio de pH acido digestivo para tener actividad enzimática

VII)

CUESTIONARIO

A. Haz los cálculos para determinar las unidades de amilasa. Amilasa (U/l) x 0,017 = Amilasa (ukat/l) Amilasa (U/l) = ∆A/min x factor* B. Explique

¿cómo

demostraste

que

el

almidón

fue

totalmente

transformado en sus subproductos al reaccionar con la amilasa? Se demostró cuando la tinción positiva con Lugol se decoloraba hasta tornarse negativa. C. Que son las Unidades (enzimáticas). ¿Todas son iguales o varían con el tipo de sustrato que usas? Una unidad de actividad enzimática se define como la actividad catalítica responsable de la transformación de un µmol de sustrato por minuto en condiciones óptimas de la enzima. Se utiliza también en combinación con otras unidades (U/mg de proteína o U/mL) para señalar, respectivamente, la actividad enzimática específica o la concentración de actividad enzimática. Las unidades necesarias para realizar la actividad estarán en medida del tipo y concentración del sustrato. D. ¿Cómo afecta el NaCl en la actividad de la amilasa? La concentración de sales del medio es crucial para una óptima actividad enzimática. Una elevada concentración o una ausencia de sales en el medio pueden impedir la actividad enzimática, ya que las enzimas precisan de una adecuada concentración de iones para mantener su carga y su estructura.

E. ¿En el ser humano, donde podemos encontrar amilasa? En el ser humano podemos encontrar amilasa en Las glándulas salivales de la boca (amilasa salival) y en el páncreas (amilasa pancreática).

F. ¿Cuál es el pH en el cual la actividad de la amilasa es óptima? El pH óptimo para que la amilasa realice su actividad enzimática, está dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para el alfa-amilasa bacteriana y pancreática.

G. Estructura de amilosa y amilopectina

H.

Describa un método para determinar azúcares reductores

REACCION DE FEHLING Determina azucares reductores (aldosas: glucosa, ribosa, eritrosa, etc.). Se trata de una reacción redox en la que el grupo aldehído (reductor) de los azúcares es oxidado a grupo ácido por el Cu2+ que se reduce a Cu+ . Tanto monosacáridos como disacáridos reductores reaccionan con el Cu2+ dando un precipitado rojo de óxido cuproso. La reacción se da en medio básico por lo que es necesario introducir en la reacción tartrato sódico-potásico para evitar la precipitación del hidróxido cúprico. La prueba de Fehling no es específica; otras sustancias que dan reacción positiva son los fenoles, aminofenoles, benzoína, ácido úrico, catecol, ácido fórmico, hidrazobenceno, fenilhidrazina, pirogalol y resorcinol.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL El reactivo de Fehling consta de dos disoluciones que se mezclan a partes iguales en el momento de su utilización. La solución I esta formada por SO4Cu* 5H2O al 7% en agua y la solución II por tartrato sódico-potásico al 35% en NaOH al 10% en agua. En un tubo se disuelven 500 mg de la sustancia a ensayar en 5 ml de agua. Se procede de igual manera con otros tubos que contengan azúcares reductores y no reductores conocidos. A continuación se añaden a todos los tubos 5 ml del reactivo de Fehling. Finalmente se someten a ebullición en baño de agua durante 5 minutos. La reacción debe considerarse positiva si se forma un precipitado rojo de óxido cuproso.

VIII. REFERENCIA BIBLIOGRAFIA 1. Rawn M. Bioquímica. Madrid McGraw- Hill

.Interamericana. 2003.

2. Miller D.D. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México. 2001. 3. Moreano M. “Determinación de azucares reductores y su relación con carbohidratos no absorbidos en niños (a) del centro de educación inicial “María Montessori” del cantón Latacunga en el período 2014- 2015 [Tesis doctoral] Ambato: Universidad técnica de Ambato facultad de ciencias de la salud carrera de laboratorio clínico; 2015 4. Claudia Patricia Lamby Tovar. La a-amilasa salival: relación con la caries dental y la salud en general. Disponible en : file:///C:/Users/PC/Downloads/4561-Article%20Text-25272-1-1020131029.pdf 5. Erik Díaz B., Carolina Aguirre P. y Martín Gotteland R. Efecto de un inhibidor de (-amilasa sobre la reducción de peso de mujeres obesas. Disponible en : https://scielo.conicyt.cl/scielo.php? script=sci_arttext&pid=S0717-75182004000300006 6. Rawn M. Bioquímica. Madrid McGraw- Hill. Interamericana. 2003. 7. Miller D.D. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, México. 2001....