BLM1001 Chapitre 2 et 3 Exercices Reponses Clonage PDF

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exercices corrigés chapitres 2 et 3 sur le clonage...

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BLM1007 AUT2019

EXERCICES - CHAPITRE 2 et 3. ADN RECOMBINANT RÉPONSES Exercice 18. ADN bactérien, plasmides et réplication I. Le chromosome d’E. Coli contient une seule molécule d’ADN bicaténaire de 3.65 106 pb. a. Calculer la masse molaire de l’ADN chromosomique bactérien Le nombre de nucléotides monophosphates est 3.65 106 pb X 2 = 7.3 106 bases Sachant que la masse molaire d’un nucléotide monophosphate est 330 g/mole On en déduit que la masse molaire de cet ADN est 330 X 7.3 106 = 2.4 109 g/mole soit 2 400 tonnes/mole b. Quelle est la longueur de cette molécule ? (pour mémoire la bactérie E. Coli mesure environ 1 µm de long) Il y a 3.65 106 nucléotides par chaine distants de 0.34nm, on en déduit que la longueur de cet ADN est de 3.65 106 X 0.35 109 = 1.23 10-3 m = 1.24 mn  1µm, taille de la bactérie → structure très compactée de l’ADN dans la bactérie II. On réalise des cultures d’E. Coli contenant, en plus du chromosome bactérien, un plasmide utilisé pour le clonage des gènes. On récolte les bactéries par centrifugation et on extrait les ADNs (ADN chromosomique et ADN plasmidique) séparément. On considère que le rendement d’extraction est de 100%. On travaille à partir de deux souches, la souche A contenant le plasmide de type pBR, de 4360 pb et la souche B contenant le plasmide de type pUC, de 2680 pb. On considère que chaque bactérie renferme une molécule d’ADN chromosomique. a. Calculer la masse d’ADN chromosomique que l’on obtient à partir de 100 mL de culture contenant 2 109 bactéries/mL D’après I., une mole d’ADN chromosomique correspond à 2.4 109g et donc contient 6.02 1023 molécules On en déduit qu’une molécule d’ADN pèse 2.4 109g/6.02 1023 = 3.98 10-15g Dans 100 mL de culture à 2 109 bactéries/mL, on a 2 1011 bactéries Or chaque bactérie contient 1 ADN chromosomique, on a donc 2 1011 ADN chromosomiques On en déduit que l’on obtient 2 1011 X 3.98 10-15g = 7.96 10-4 g d’ADN chromosomique soit 796 µg On récolte également 20 µg d’ADN plasmidique à partir de la souche A et 50 µg d’ADN plasmidique à partir de la souche B. b. Calculer le nombre de copies de plasmides dans chaque souche de bactérie. Rappels : MM : 330g/mole pour un désoxyribonucléotide monophosphosphate (incorporé dans l’ADN) Selon le même raisonnement: La masse molaire de l’ADN plasmidique pBR de 4360 pb = 4360 pb X 2 X 330 g = 2.8776 106 g/mole La masse moléculaire d’un plasmide pBR est 2.8776 106 /6.02 1023 = 4.78 10-18g On récolte 20 µg de plasmide pBR, soit 20 10-6 g. On en déduit le nombre de pBR que l’on a est 20 10-6 / 4.78 10-18g = 4.2 1012 1

BLM1007 AUT2019 On a donc 4.2 1012 molécules de pBR pour 2 1011 bactéries soit 4.2 1012 / 2 1011 = 21 copies du plasmide par bactérie En faisant les mêmes calculs pour le plasmide pUC on en déduit que chaque bactérie renferme 85 copies de pUC → le nombre de copies diffère entre différents types de plasmides: cf Ori Données : Deux nucléotides successifs sont distants de 0,34 nm dans l’ADN Nbre Avogadro = 6.02 1023 molécules/mole

Exercice 22. Enzymes de restriction et clonage La séquence indiquée dans la figure 1 correspond à l’unique exon du gène A. Le codon initiation de la traduction et le codon stop sont soulignés dans la séquence CCCCAGACTT CGGCCCCATG CGGCTCACCG CTGCCAGGCT GCCCTGGCGG CCGCCATCAC CCTCAACCTT CGGCTGAAGC CCTGATAACC TCGCCTTTGT TTTTCGGGGG Figure 1 Séquence de l’unique exon du gène A

Afin de l’insérer dans un vecteur d’expression eucaryote, on souhaite récupérer l’intégralité de la séquence codante. Parmi la liste des enzymes de restriction proposées, quelle(s) stratégie(s) permettrai(en)t d’obtenir l’intégralité de la séquence codante ?

Enzymes 1 2 3 4 5 6 7 8

Site de restriction CTGAA/G CCATCNNNNNN/N C/CNNGG CG/RYCG Y/GGCCR CCTTCNNNNNN/N GGN/NCC G/GNCC R= purine; Y=pyrimidine; N=A, T, C ou G

A. Digestion par les enzymes 2 et 6 B. Digestion par les enzymes 5 et 7 C. Digestion par les enzymes 1 et 7 D. Digestion par les enzymes 6 et 8 E. Digestion par les enzymes 3 et 4 Les enzymes 2, 3, 4 et 5 pas utilisables car dans la séquence codante

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BLM1007 AUT2019 Exercice 23. Enzymes de restriction et clonage Soit le fragment d’ADN suivant: on utilise juste EcoRI 5’…GAG AATTCAA…CCG AATTCCC…3’ 3’…CTCTTAA GTT…GGCTTAA GGG…5’ Soit d’autre part le vecteur pUC18 : EcoRI polylinker HindIII 5’…g aattc………………….aagctt…3’ 3’…cttaa g………………….ttcgaa…5’ Écrire la séquence du plasmide recombinant obtenu (en conservant la convention lettres Majuscules pour l’insert, minuscules pour le vecteur). 5’…GAATTCAA…CCGAATTC…3’ 3’…CTTAAGTT…GGCTTAAG…5’ En rouge le vecteur – en noir le fragment

Exercice 26. Enzymes et cartes de restriction Un ADN linéaire de 10 000 pb a été obtenu après digestion par l’enzyme de restriction EcoRI. Ce fragment d’ADN est ensuite digéré par différentes enzymes de restriction. Après chacune des digestions, les fragments de restrictions obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose et visualisés après coloration du gel à l’aide d’un intercalant. La taille des différents fragments observés est précisée ci-dessous. Enzymes utilisées SacI BamHI HindIII SacI et BamHI SacI et HindIII BamHI et HindIII SacI, BamHI et HindIII

Tailles des fragments de restrictions observés (kb) 7.5 et 1.25 7.5 et 2.5 5 et 2.5 6.25 et 1.25 3.75, 2.5 et 1.25 2.5 2.5 et 1.25

Déterminer la carte de restriction du fragment de 10 000 pb

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BLM1007 AUT2019 Exercice 28 : carte de restriction et clonage La séquence d’ADN ci-dessous correspond à une partie d’un gène humain. TGACCCAGCC TGGAAGCTCT AAGACCCGCC CGGGGGCCCT TGCAGAAGCG TACCAGCTGG

GCAGGCATGG CTACCTAGTG GGGAGGCAGA GGTGCAGGCA TGGCATTGTG AGAACTTCTG

TGAACCAACA TGCGGGGAAC GGACCTGCAG GCCTGCAGCC GAACAATGCT CATCTAGACG

CCTGTGCGGC GAGGCTTCTT GTGGGGCAGG CTTGGCCCTG GTACCAGCAT CAGCCCGCAG

TCACACCTGG CTACACACCC TGGAGCTGGG GAGGGGTCCC CTGCTCCCTC GCAGCCCCCC

1. Quelle est la séquence complémentaire des 10 premières paires de bases ? A. 5’ GGCTGGGTCA 3’ B. 5’ ACTGGGTCGG 3’ C. 3’ ACTGGGTCGG 5’ D. 3’ GGCTGGGTCA 5’ E. 5’ TGACCCAGCC 3’ 2. Vrai/Faux : les enzymes de restriction : A. Elles coupent une séquence spécifique de l’ADN B. Deux enzymes de restriction différentes ne peuvent jamais couper la même séquence C. Elles sont d’origine virale D. Elles sont nécessaires pour réaliser une analyse d’ADN par Southern Blot E. Elles appartiennent à la famille des nucléases

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BLM1007 AUT2019 3. Ce fragment d’ADN est digéré par l’enzyme de restriction PvuII (CAG/CTG) et PstI (CTGCA/G). Quel est le nombre et la taille des fragments obtenus ? 5 4. Vrai/Faux : On souhaite amplifier l’intégralité de cette séquence par PCR. A. Cette technique permet de répliquer in vitro la matrice d’ADN B. Après 35 cycles d’amplification, la matrice d’ADN est amplifiée environ 1000 fois C. Cette technique utilise des cycles successifs D. Cette technique permet d’amplifier un fragment d’ADN ayant une longueur de 100 000 pb. E. Cette technique est réalisable avec n’importe quelle ADN polymérase 5. Quelle amorce sens faut-il choisir pour amplifier ce fragment ? A. ATGGCCTCTTCTGATGCAGC B. TGACCCAGCCGCAGGCATGGTGAA C. GGCCTCTTCTGATGCAGC D. TGACCCAGCCGCAGGCATGG E. TGACCC 6. Quelle amorce anti-sens faut-il choisir pour amplifier ce fragment ? A. CAGCCCGCAGGCAGCCCCCC B. GGGGGGCTGCCTGCGGGCTGCGTC C. GGGGGGCTGCCTGCGGGCTG D. CAGCCCGCAGGCAGCC E. CAGCCCG 7. Parmi les enzymes suivantes, laquelle (lesquelles) a (ont) besoin d’une amorce pour initier leur action enzymatique ? A. L’ARN polymérase II B. La transcriptase inverse C. La Taq polymérase D. La polynucléotide kinase E. L’ADN polymérase I 8. On considère que l’amplification a été réalisée avec succès. Choisir parmi les sondes proposées celles qui peuvent s’hybrider avec la région soulignée. A. GTGGGGCAGGTGGAGCTCGG B. TGGAGCTGGGCGGGGGCCCT C. CCCAGCTCCACCTGCCCCAC D. AGGGCCCCCGCCCAGCTCCA E. CGGGGGCCCTGGTGCAGGCA 9. Sachant que l’amplification a été réalisée avec succès, choisir parmi les différentes propositions celles qui pourraient permettre l’insertion de la région 1 dans le multiple site de clonage du vecteur pCMV-Script. A. Digestion de l’amplicon et du vecteur pCMV-Script par PstI puis ligation à l’aide d’une ADN ligase. B. Digestion de l’amplicon et du vecteur pCMV-Script par PstI et PvuII puis ligation à l’aide d’une ADN ligase.

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BLM1007 AUT2019 C. Digestion de l’amplicon par PstI et PvuII et digestion du vecteur pCMV-Script par PstI puis ligation à l’aide d’une ADN ligase. D. Digestion de l’amplicon et du vecteur pCMV-Script par AluI (AG/TC) puis ligation à l’aide d’une ADN ligase. E. Digestion de l’amplicon par PstI et digestion du vecteur pCMV-Script par AluI puis ligation à l’aide d’une ADN ligase. Une autre expérience a permis d’insérer l’intégralité de la séquence de 300 pb dans le vecteur pCMV-Script. Le vecteur utilisé étant un vecteur d’expression eucaryote, ce fragment peut être transcrit et traduit. En admettant que le brin d’ADN servant de matrice pour la transcription de ce fragment le brin complémentaire de celui indiqué à figure 1, répondre aux questions 10 et 11. 10. Parmi les propositions suivantes, laquelle correspond aux 10 premières bases de l’ARN ? A. UGACCCAGCC B. GCAGCCCCCC C. GGCUGGGUCA D. GGGGGGCUGC E. CCGACCCAGU 11. Parmi les propositions suivantes, lesquelles pourraient correspondre aux 3 premiers acides aminés de la protéine synthétisée à partir de ce fragment d’ADN ? (le vecteur utilisé ne fournit aucun codon d’initiation de la traduction) A. Met-Val-Asn B. Pro-Ser-Arg C. Gly-Gly-Leu D. Pro-Pro Asp E. Met-Gln-Lys En admettant que le brin d’ADN servant de matrice pour la transcription de ce fragment le brin indiqué à figure 1, répondre aux questions 12 et 13. 12. Parmi les propositions suivantes, laquelle correspond aux 10 premières bases de l’ARN ? A. UGACCCAGCC B. GCAGCCCCCC C. GGCUGGGUCA D. GGGGGGCUGC E. CCGACCCAGU 13. Parmi les propositions suivantes, lesquelles pourraient correspondre aux 3 premiers acides aminés de la protéine synthétisée à partir de ce fragment d’ADN ? (le vecteur utilisé ne fournit aucun codon d’initiation de la traduction) A. Met-Val-Asn B. Pro-Ser-Arg C. Gly-Gly-Leu D. Pro-Pro Asp E. Met-Gln-Lys 6

BLM1007 AUT2019 Exercice 29. Clonage Un fragment d'ADN KanR est cloné dans le vecteur pBR322, au niveau du site unique de restriction Eco RI dont la séquence est : 5 ' ---- G/AATTC ----3 ' 1. Quel type d'extrémité génère une telle coupure? Bout cohésif 2. Pour déterminer la taille de ce fragment KanR inséré dans le vecteur pBR322, on fait une digestion par l'enzyme de restriction Kpn I. Ce site est absent du vecteur pBR322. Or on génère un fragment de 4500 paires de bases et un fragment de 1000 paires de base. Que peut-on conclure sur le nombre de sites Kpn I présents dans KanR et quelle est la taille de KanR, sachant que pBR322 fait 4400 paires de bases. 2 sites Kpn1 Taille totale du plasmide + fragment = 4500 + 1000 = 5500 (cf digestion par kpn1) or la taille du vecteur est 4400 pb : donc fragment = 5500-4400 = 1100 pb 3. L'enzyme de restriction Sma I coupe dans le vecteur à 1000 paires de bases en amont du site EcoRI qui a servi à intégrer KanR. Une digestion Sma I génère un fragment de 1600 paires de bases et un fragment de 3900 paires de bases. A combien de paires de bases du site Eco RI se situe le site Sma I présent dans l'insert? 600pb Exercice 30. Clonage Un chercheur veut cloner un fragment d’ADN génomique de 2kb d’Arabidopsis thaliana dans le vecteur pBLQ54

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BLM1007 AUT2019 1. Proposer un protocole de clonage pour construire un plasmide recombinant (les enzymes utilisées sont EcoRI et BamHI ; pBLQ54 porte le résistance à l’ampicilline) Le plasmide recombinant obtenu est appelé pARABIDO. 1. Digestion du plasmide par EcoRI et BamHI, electrophorese pour séparer les fragments et extraction du vecteur linearisé du gel (5000pb) 2. Digestion du fragment a cloner par EcoRI et BamHI, electrophorese pour séparer les fragments et extraction du fragment EcoRI/BamhI du gel (2000pb) 3. Ligation avec la T4 ligase 4. transformation des bactéries compétentes 5. culture des bactéries sur un milieu selectif 6. analyse des colonies par carte de restriction vecteur pARABIDO

2. Présenter un schéma de pARABIDO en positionnant les différents sites de restriction. Pour contrôler le résultat du clonage, le chercheur fait une analyse par restriction de pARABIDO en utilisant les enzymes HindIII et PvuII séparément puis en réalisant une électrophorèse en gel d’agarose. Schématiser ce qu’il doit observer à l’issue de l’électrophorèse pour les deux digestions enzymatiques en indiquant les tailles des différentes bandes obtenues.

Eco HindIII

50 PvuII

10

10 15 PvuII

BamHI

20

50

50

HindIII PvuII

8

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HindIII pBLQ54

pARABIDO

3500

PvuII pBLQ54

pARABIDO

3500 2500 2000

2500

1500 1000

Exercice 31. Clonage et enzymes de restriction L’ADN du plasmide pBR322 est circulaire et compte 4363 paire de bases (pb). Il est soumis à l’action de 5 enzymes de restriction et les produits des digestions enzymatiques sont soumis à une électrophorèse sur gel d’agarose. Les résultats sont reportés ci-dessous. Les tailles des fragments produits par TaqI sont : 1444 pb, 1307 pb, 475 pb, 368 pb, 316 pb, 312pb, 141 pb.

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BLM1007 AUT2019 1. Combien de sites sont reconnus par chacune des ezymes de restriction ? EcoRI (1) BamhI (1) HindCII (2) TaqI (7, la somme des fragments est bien égale à la taille du plasmide) PvuII (1) Note toujours faire la somme des fragments pour etre certains de ne pas en oublier ! 2. On veut établir la carte des sites de restriction de ce plasmide pour 4 enzymes à partir des résultats reportés dans le tableau ci-dessus. a. Représenter le plasmide par un cercle que l’on oriente selon 2 conventions : - le site EcoRI a l’ordonnée 1 - le site unique BamHI est placé de telle sorte que, partant de 1, la distance à parcourir pour atteindre ce site soit la plus courte lorsqu’on tourne dans le sens des aiguilles d’une montre. b. Placer les différents sites EcoRI, BamHI, PvuII, HincII.

EcoRI 1 BamH1 375 HincII 3905

HincII 649 4363 pb

PvuII 2066

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BLM1007 AUT2019 Exercice 32. Clonage Note : Avant de commencer, vous devez aller cherchez dans les bases de données les caractéristiques des différentes enzymes de restriction. Vous pouvez aller sur le site de NEB.

La séquence soulignée dans l’insert est un site de restriction à déterminer. XbaI En supposant que vous transformez ce plasmide dans une souche de E. Coli possédant une résistance à la kanamycine. Répondez aux questions suivantes : 11

BLM1007 AUT2019 1. Sur quel(s) antibiotique(s) pouvez-vous faire votre sélection ? Ampicilline 2. Quelle taille de fragments obtiendrez-vous si vous coupez avec AflIII? 1184 et 2789 pb 3. Si vous coupez avec Pst1 et religuer le plasmide que se passe t-il pour kanR ? Un morceau de la sequence de KanR est perdu, le plasmide ne confert plus la resistance à la kanamycine 4. Vous souhaitez amplifier le gène qui possède la séquence ci-dessus dans le multisite de clonage. Ajouter des sites de restriction appropriés dans vos amorces (10 bases d’appariement) Choisissez des enzymes qui coupent à la même température et qui ont la meilleure efficacité possible dans le tampon choisi. (BamHI et PstI fonctionne dans le tampon BahmHI) Calculez la Tm effective de vos amorces calcule avec le pte formule L’amorce gauche portera la sequence BamHI et l’amorce droite la séquence droite la squence PstI en 5’ 5. Vous coupez votre plasmide (sans insert) avec ApaL1. Vous faites migrer votre digestion sur gel, purifiez un fragment de 2700 pb et transformer ce fragment dans E. Coli, que se passe-t-il ? Le nouveau vecteur obtenu à perdu son origine PuC il ne sera donc pas capable de s autorepliquer. Les bacteries obtenues n’auront pas de plasmides (sauf les qq bacteries qui auront intergre le plasmide pendant la transformation, mais les bacteries filles issues n’auront pas de plasmides 6. Lors de la ligation de votre insert dans le vecteur, vous vous trompez dans vos calculs et mettez du plasmide en excès. Que se passe t-il? Statistiquement il y aura moins de chance que votre fragment soit integre au vecteur, il y aura donc presque uniquement voir uniquement des bacteries avec le plasmide sans insert 7. Vous vouliez couper EcoR1 mais le tube de EcoR1 est vide, quel isoschizomer pouvez-vous utiliser ? voir bases de données : ex sacI 8. Vous avez réussi à rentrer votre insert dans le vecteur par clonage directionnel HindIII/EcoR1. Avec quelles enzymes pouvez vous l’en ressortir ? HindIII/EcoR1. 9. Vous avez cloné l’insert de façon non directionnelle dans EcoR1. Vous voulez maintenant savoir son orientation, comment procédezvous (par restriction) ? Pour distinguer les 2 orientations possibles du fragment insere il faut prendre une enzyme de restriction présente dans l’insert (non situé au centre de l’insert) et dans le vecteur. Il faut digerer les vecteurs recombiné avec cette enzyme et faire une carte de restriction 10. a. Vous voulez faire une ligation avec un excès d’insert de 4X. Vous souhaitez mettre 100ng total d’ADN dans votre ligation. Si le vecteur fait 4000 pb de base et l’insert à la même taille, combien de ng mettez vous de chaque ? 20 ng de vecteur et 80 ng d’insert b. Si l’insert faut 1000 pb et le vecteur 4000 pb ? 50 ng d’insert et 50 ng de vecteur : il faut tenir compte du fait que la taille du vecteur est 4X plus grande 12...