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Cours sur le clonage...

Description

LE CLONAGE Les clonage cellulaire est la multiplication qui peut être naturelle ou artificielle d’organismes vivants avec conservation exacte du même génome pour tous les descendants (les clones). ! Le clonage moléculaire, c’est dans la cellule qui est une technique de biologie moléculaire qui consiste à isoler et amplifier une molécule d’ADN double brin. ! Quand on clone, on isole et on amplifie. Pour cela on utilise des outils, du génie édénique ou de la «"technologie de m’ADN recombinant"» ! On fait le clonage pour séparer, identifier, manipuler et exprimer un fragment d’ADN spécifique. ! Quand on identifie, on séquence. C’est une identification de polymorphisme de séquence, de mutations. ! Quand on manipule, on corrige des mutations (thérapie génique), on améliore les espèces (plantes, animaux), OGM. ! Quand on exprime, on produit des protéines recombinantes (insuline, facteur de croissance…). !

On aura toujours besoin d’un vecteur de clonage (= molécule d’ADN distincte de l’ADN génomique) et d’un insert (= molécule d’ADN généralement linéaire, qui projet d’un organisme donneur). ! Ensuite, ces 2 choses vont être mise ensemble. On va obtenir un vecteur recombinant ; quelque chose hybride, puis on sélectionne et on amplifie. ! Vecteurs de clonage ! Les vecteurs utilisés en génie génétique ont souvent une origine naturelle (plasmides, bactériophages), mais ont été largement modifiés. ! Il y a une grande diversité de vecteurs : plasmides, bactériophages, cosmides / phagemides, chromosomes articles de bactéries BAC…! Tous ces vecteurs possèdent des caractéristiques communes et indispensables dont une ; qui est de se répliquer de manière autonome et efficace. ! La taille des inserts à cloner détermine le choix du vecteur utilisé : !

! Plasmides • Petites molécules d’ADN bicaténaire (= double brin) et circulaire! • Présentes naturellement dans la bactérie ! • Multicopies ; pas une seule copie! • Indépendantes de l’ADN bactérien ; bleue pas à l’intérieur du rouge sur le schéma —> doit savoir se répliquer de manière autonome ! • À réplication autonome avec une origine de réplication !

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• Transmises à la descendance ! • Non indispensable à la croissance, mais avantage sélectif ! • Transférable entre bactéries principalement par le phénomène de conjugaison !

Dans un plasmide naturel sauvage, ces plasmides possèdent certaines séquence (en rose) qui vont permettre la synthèse de substance qui vont permettre de résister à des antibiotiques. ! Pour notre clonage, on veut avoir un plasmide et faire rentrer une séquence d’ADN étrangère. On imagine un insert, celui ci on veut le faire rentrer dans le plasmide.!

Cartographie Sur ces structures, on s’est aperçu qu’on était peut tire capable de prendre des ciseaux et de couper. Quand on analyse, on reconnait l’enzyme qui s’appelle EcoR1, on a la possibilité grâce à EcoR1 de mettre un coup de ciseau dans la structure. Si on la coupe, on ouvre et permettre à de l’ADN étranger au niveau de l’ouverture. ! Ces sites de coupures sont appelés des sites de restrictions. ! Lorsqu’on positionne et identifie chaque site de restrictions avec le nom de l’enzyme de restriction qui le reconnait, on établit une carte de restriction. ! On répertorie tous les sites de restrictions reconnue par des enzymes de restrictions. ! Ici, on a prit des enzymes de restrictions qui ne coupent qu’une seule fois. ! C’est comme une carte routière. Les noms d’enzymes ici, sont comme des noms de villes. ! Quand on va couper, on obtiendra un fragment de restriction. Pur obtenir la taille de celui-ci on fait une soustraction. ! Enzymes de restriction et sites de restriction Les enzymes de restrictions sont endonucléases spécifiques d’une séquence d’origine bactérienne. Elles hydrolysent la liaison phosphodiester qui relie les nucléotides ensemble. ! Sites de restrictions : séquence d’ADN double brin reconnues spécifiquement par les enzymes de restriction (4 à 15 pb)! Ces enzymes sont des protéines qui viennent de bactérie elle-même. Seules les bactéries synthétisent des enzymes de restrictions qui ont pour but de couper l’ADN. C’est un mécanisme de défense car les enzymes vont couper une séquence particulières de virus. !

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Digestion

Il peut y avoir différentes fréquences de coupure. Les enzymes de restrictions peuvent couper de l’ADN étranger. Cela limite les infections virales chez les bactéries, d’où le terme de restriction. !

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Palindrome de lettres C’est une phrase qu’on peut lire dans un sens comme dans un autre. ! Quand on regarde notre séquence, sur un brin on va avoir GAATTC, on peut avoir le même brin dans l’autre sens. !

Quand ont connaît un tel palindrome, l’enzyme ne coupe pas au même endroit sur les 2 brins. Sur cette séquence, le coup de ciseau est entre le G et le A. On va faire des sortes de «"pièces de puzzle"» qui a des extrémités sortantes/ cohésives (peuvent être coller). ! Quand on regarde d’autres enzymes, il y a différentes extrémités générées. !

Ces sites et enzymes de restrictions coupent l’ADN. On a aussi des enzymes qui recollent. ! On a une autre enzyme de modification ; une T4 DNA ligase. Celle ci fait l’inverse de l’enzyme de restriction. Quand elle voit cette pièce de puzzle, elle recréer la liaison phosphodiester qui existe. ! Une enzyme de restriction est une protéine capable de couper un fragment d’ADN au niveau d’une séquence de nucléotides caractéristiques appelée «"site de restriction"» C’est une endonucléase (coupure à l’intérieur du brin d’ADN au niveau des liaisons phosphoester). ! Plusieurs centaines d’enzymes de restrictions sont actuellement connues, dont un grand nombre se retrouve naturellement chez la bactérie. En effet, les enzymes de restriction peuvent couper (et ainsi conduire à la destruction) de l’ADN étranger (notamment des virus). ! Extrémités compatibles ! La 1ère enzyme coupe entre les 2G et la deuxième reconnait une séquence palindromique différente. Quand elle génère des pièces de puzzle (violet), on va avoir le bout violet qui part d’un coté et le bout jaune de l’autre. Le bout CTAG sont les mêmes qu’en bas. ! !

! On peut faire des échanges.! On peut recoller une extrémité Bam H1 à une extrémité Bgl II, mais le fragment à la fin ne possède plus de Bam H1 et de Bgl II. ! Dans de tel cas, on parle d’extrémités compatibles. Ce ne sont pas totalement les mêmes mais elles s’emboîtent. ! Ca va s’emboiter mais on peut avoir des choses qui s’emboîtent sans être complémentaire. ! La plupart des extrémités sortantes ne sont donc pas «"compatibles"» !

! Le cas partiaire des «"bouts francs"» Quand on a 2 enzymes, en terme de reconnaissance de palindrome, ce n’est pas tout à fait la même chose. Hae III reconnait un palindrome plus cours que Sma I. Ces 2 enzymes forment les modes pièces de puzzle et on peut avoir 7 pièces de puzzle qui vient s’associer. ! Cela reste compatible, mais à la fin, quand tout est recoller, on ne fait ni le site Sma I, ni le site Hae III. !

Ces plasmides naturelles ont été modifié pour créer un site de multiple de clonage (MCS). C’est une séquence d’ADN assez courte en faisant en sorte qu’il y a plusieurs sites de restrictions les uns à coté des aires. ! On intègre un palindrome que reconnaîtra par exemple, l’enzyme Nco I et pareil pour les autres enzymes. ! Sur une courte distance du plasmide, on a la possibilité de mettre une enzyme de restriction Nco I qui coupe notre plasmide, et si on ne veut pas couper à cet endroit, on coupera au niveau de EcoR I ou ailleurs. ! On va avoir le choix entre plusieurs sites de restrictions, donc le choix entre plusieurs enzymes. ! Ces plasmides sont modifiés pour devenir des vecteurs de clonage plasmidiques. Ce vecteurs de clonage plasmidiques, il y a 2 autres propriétés : celle de posséder une séquence qui permet l’expression d’une résistance à un antibiotique (en rose), et on a besoin d’une réplication pour faire pleins de copies (en vert). !

Le principe d’un clonage est d’utiliser des vecteurs de clonage. Dans ces vecteurs, on a prit un exemple ; les plasmides. Quand on parle de plasmide, on parle de site de restriction et d’enzymes de restrictions. ! Les inserts Il y a différentes sources d’ADN. La source d’ADN peut être déjà ou nouvellement synthétisés. L’ADN déjà synthétisé est l’ADN génomique ou plasmidique. ! On imagine un plasmide. On se dit que dans le plasmide, dedans on a un rangement d’ADN qui nous intéresse. On veut le prendre et le cloner. ! Si on a un site de restriction juste avant et juste après, en utilisant les bonnes enzymes qui reconnaissent ces sites, on va pouvoir découper et générer un fragment de restriction qui sera notre insert. ! Si on prend dans le génome, il faut que l’on puisse récupérer cette séquence. C’est ce qu’on appelle donc, les sources d’ADN déjà synthétisés. ! On peut aussi faire autrement. Ce fameux insert provenant d’un autre organisme, on peut nouvellement le synthétiser. On imagine que c’est toujours le même plasmide, où on a pas d’enzyme de restriction, pas de moyen de découper et d’extraire la séquence d’ADN du plasmide pour la mettre ailleurs. ! Dans ce cas là, on l’a recopie grâce à des amorces. ! L'insert n’est pas un fragment de restriction, mais un produit PCR. L’extrémité à droite en bleu est une extrémité dite franche. ! On peut rajouter ce qu’on appelle des queues flottantes à nos amorces. Les m’amorces en s’hybridant vont pouvoir recopier la zone qui existe, mais on peut ajouter un bout d’ADN qui était flottant au début. De façon artificielle, on va pouvoir avoir le fragment d’ADN qui nous intéresse et rajouter de part et d’autres des sites de restrictions. ! Si on les rajoute, on va pouvoir utiliser les enzymes rouges et vertes pour fabriquer un fragment. En digérant, on fabrique un fragment. !

Quand on va utilisé la PCR, on peut faire de 2 façons ; soit en mettant des amorces tout à fait classique et on a un fragment d’ADN qui n’est pas un fragment de restriction. Si on veut que les extrémités soient différentes, on va utilisé des queues flottantes. ! On va pouvoir digérer par les enzymes de restrictions et fabriquer un fragment de restrictions, qui aura une extrémité à gauche différente de celle de droite. ! ! Les acteurs en présence

! Première chose à faire, pour faire rentrer de l’ADN étranger, on le digère par des enzymes de restriction. On décide d’utiliser 2 enzymes de restrictions différentes. ! On va ouvrir le plasmide. Enter les 2, il y a de la séquence. Ce petit bout on va l’éliminer et mettre autre chose. ! À l’endroit de EcoR I, on a un extrémité 5’ sortante. Le morceau en en haut à droite est un bout d’ADN mais pas un insert. !

Ensuite, il faut emboiter l’insert digéré et coller. C’est grâce à la ligation et l’enzyme T4 DNA ligase que l’on colle.! L’insert et le vecteur ont des bouts qui sortent. Il va y avoir une liaison phosphodiester entre ces 2. ! Et chacune des bases va reconnaitre son complémentaire et créer de liaison plus faibles ; les liaison hydrogènes. ! Le vecteur se ligue à l’insert. Il va ensuite se passer que la T4 DNA ligase va recevoir de l’app qui va permet d’associer le 5’ phosphate avec le 3’ OH. ! Une fois que des deux cotés, il y a le collage, il y a d nouveau une structure circulaire mais plus grand. On parle donc de vecteur recombinant. !

Le terme recombinant n’a aucun rapport avec le mot recombiner. Le recombinant est un vecteur de clonage et un insert. ! Et recopier correspond à une recombinaison homologue. !

Il y a différents types de clonage suivant les enzymes et sites de restriction utilisés. ! Il peut y avoir un clonage orienté. C’est qu’on fait référence à la façon dont l’insert rentre dans le vecteur. La façon dont on va avoir préparer notre insert, et ce qu’il possèdera aux extrémités, il va y avoir qu’une façon d’emboîter l’insert dans le vecteur. ! Si l’insert a fait un 360°, on se demande si l’insert rentre comme ceci dans le vecteur. Cela ne fonctionnera pas car les bases qu’il y a dans les séquences qui dépassent ne sont pas complémentaires. ! Si on utilise 2 enzymes différentes, le clonage sera forcément orientés ? ! Ce sera un clonage non orienté. Quand on va recoller, le site de restriction !

Le clonage non orienté est obtenu quand on décide d’ouvrir notre plasmide en utilisant qu’une seule enzyme. On donne qu’un coup de ciseau qui ouvre notre plasmide.! On peut avoir l’insert qui se met dans différents sens mais avec les extrémités qui peuvent toujours s’associer. ! On va de ce clonage, pouvoir obtenir 2 vecteurs recombinant différents à la fin. ! Comment différencier ces vecteurs recombinant ? En faisant une carte de restriction. La cartographie, on va faire un plan qui va donner les distances entre les sites de restrictions. ! Sur le schéma, le site est plus proche de Xho 1 en bas à droite que par rapport à en bas à gauche. ! Il va y avoir un fragment plus petit pour le gauche et plus grand pour le droit. ! Dans le cas d’un clonage non orienté, le danger est que le vecteur peut se refermer sur lui-même. Pour éviter cela, on va déphosphorer en traitant le vecteur, et on le met en présence d’une enzyme ; la phosphatage alcaline. Elle va déphosphorer les extrémités 5’. ! Cas type de clonage non orienté : clonage des produits PCR Lorsqu’on clone les produits PCR, soit on a le choix de mettre des amorces pour former un produit PCR. Quand on regarde les extrémités, elles sont 5’ OH car nos amorces sont des petits oligo de synthèse. ! Quand on les commande, on les obtient par synthèse chimique, il n’y a pas de groupement phosphate en 5’. Chacune des amorces qui constituent la séquence PCR. ! On utilise une enzyme qui permet des extrémités franches. Si on enlève pas les groupement phosphate, ils vont vouloir se mettre ls uns sur les autres et se refermer. ! On utilise la T4 polynucléotide kinase pour phosphoryler. !

Le clonage des produits PCR est toujours non orienté ? ! Pour avoir un clonage orienté, on ajoute des queues flottantes sur nos amorces. ! Il est possible de ne pas avoir de part et d’autres de l’ADN des sites de restrictions, donc on va pouvoir amplifier par PCR un fragment qui nous intéresse. ! Cet insert là, on veut le cloner dans un vecteur et ce vecteur, on veut que ce clonage soit un clonage orienté. On va pouvoir aussi, si on veut orienté notre clonage avec un autre vecteur de près. Il a des pièces de puzzle particulières. ! On ajoute les sites de restrictions en utilisant des queues flottantes qui possèdent le sites de restriction reconnus par EcoRI et par l’enzyme 2. !

En faisant la PCR aux marches particulières, on va pouvoir rajouter les extrémités et faire devenir un fragment de restriction qui pourra s’emboiter dans un seul sens. ! Le fragment d’ADN d’intérêt ne contient pas forcément les bons sites de restriction. ! Comment peut on les ajouter aux extrémités de l’ADN à cloner ? Pour cela se fait par PCR avec des amorces spéciales. !

Quand on rajoute des queue flottantes, quand on commande l’amorce de PCR, on va dire qu’elle contient en plus cette séquence en 5’. Cette séquence en 5’ sera la séquence d’un palindrome. !

Ensuite, on obtient le schéma ci dessous. ! !

On obtient un vecteur recombinant. Quand on a le vecteur recombinant, c’est le nom que va porter, quand ont l’insert rentrer dans le vecteur. ! Ce n’est pas un vecteur recombiner mais recombinant. !

! Amplification de l’ADN recombinant Le vecteur recombinant possède un gène résistant à l’antibiotique et un insert. ! On va transformer notre bactérie car on lui apporte de l’ADN exogène ; càd qui ne lui appartient pas. ! Comment ? ! On fait une chimiotransfromation des bactéries qui passe par un petit traitement pour les rendre compétente. ! Compétente veut dire qu’on va les trader pour faciliter l’entrée d’ADN. Leur paroi va être fragiliser par un traitement chimique au chlorure de calcium. !

Il faut préparer les bactéries au préalable. Une fois que ces bactéries sont compétentes. On les mélange avec tous le produit de ligation (vecteur en contact avec l’insert en présence de T4 DNA ligase). Puis tous ça est mis dans la glace. ! Quand on laisse incuber un moment, on va faire un choc thermique à 42°. Les molécules d’ADN vont rentrés dans les bactéries à ce moment là. Grâce a ce traitement au chlorure de calcium, au moment où on augmente la T°, les membranes vont devoir perméable à l’ADN qui va donc entrer. ! Il y aura qu’une seule molécule qui va pouvoir rentrer dans les bactéries. Cette transformation est le moyen e trier les différentes molécules qu’on a dans notre produit de ligation. ! Quand on fait rentrer une molécule dans la bactérie, on rajoute du milieu nutritif sans antibiotique pour que la bactérie pousse et exprime les gènes de résistance à l’antibiotique. C’est l’étape d’expression phénotypique. ! Le produit de ligation, il n’y a pas simplement ce vecteur recombinant mais un mélange de molécules. On va avoir le vecteur combinant mais va nous rester des inserts qui ne seront pas rentrer dans le vecteur. Il peut aussi y avoir des inserts qui se sont collés entre eux. ! On peut aussi avoir des vecteurs sauvages ou parentals. On a un mélange de molécules. !

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On peut avoir des bactéries qui n’auront rien reçu, des bactéries recevant des vecteurs ou des bactéries recevant des vecteurs vides. On veut faire pousser des bactéries qui ont reçu des vecteurs recombinant.!

Sélection des bactéries transformées Parmi tous les produits de ligation que l’on obtient, on sélectionne les bactéries qui possèdent des vecteurs intéressants. ! Quand on a reçu un vecteur, on a forcément le gène de résistance à l’antibiotique. ! A chaque fois, ça pousse car il y a une résistance à l’antibiotique.!

Parmi les bactéries enfermés pourront avoir le vecteur recombinant ou le vecteur sauvage. ! On veut conserver que celle avec le vecteur recombinant et appelle cela l’étape de criblage. ! On peut faire un criblage par PCR sur les colonies bactériennes directement. Il y pleins de bactéries sur la boite de pétri. On prend des bactéries, un cure dent et on va rincer et nettoyer le cure dent dans un tube. ! On va faire pareil avec la bactérie voisines etc. Dans ce tube, on va mettre tous ce qui faut pour faire une PCR. Les amorces PCR on les choisit de manière ; on imagine qu’on a insert. Il y aura une amorce qui s’hybride sur chaque extrémités (EcoRI et BamHI). ! Aucune réaction PCR ne pourra se faire car les 2 extrémités s’hybrident l’une derrière l’autre pour celui où il n’y a aucun produit PCR. !

Extraire un plasmide

La soude permet de rompre les liaison hydrogènes. ! La neutralisation permet de renaturer le plasmide car il est petit.!

Criblage par cartographie physique

L’insert s’est mis dans un sens, en bas il s’est mis dans l’autre sens. C’est le même insert de 600 pb. Lorsqu’on fait une digestion avec l’enzyme SmaI, on va avoir un fragment de 800 pb alors que dans l’autre sens il fera 200 pb. ! Quand on va avoir les plasmides, grâce à l’utilisation de site de restriction et d’enzymes de restriction différentes, on aura des cartes de restrictions différentes. ! ! Criblage par interruption de gène ! Ca porte aussi le nom de test de l’alpha-complementation (blanc/ bleu). ! Ca veut dire qu’on a utilisé un vecteur de clonage particulier. En haut, il y a la position une, donc la paire de base n°1. ! SapI est donc un site de restriction reconnue par une enzyme de restriction. C’est à cet endroit qu’il y aura une coupure. !

On va pouvoir ouvrir au niveau de MCS. Dans le MCS, on retrouve différents sites de restrictions, mais cette coupure sera unique. ! Il y a un gène de résistance à l’ampicilline. L’étape de criblage ; parmi les bactéries qui ont poussé sur ampicilline, on choisit uniquement celle qui possède un vecteur recombinant. ! L’origine de réplication permet la réplication de manière indépendante. Il va amplifier toute cette séquence d’ADN, y compris l’insert. ! Le lac z code pour la beta-galactosidase. Sur ce vecteur, il ne code pas pour toute la beta-galactosidase, mais pour le peptide alpha seulement. La beta-galactosidase est la grande so...