BVT II VL Fragen PDF

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Fragen katalog und die Antwort...

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Rühren & Mischen, Scale Up 1. Wieso ist mischen ein wichtiges bzw. hauptsächliches Problem in Bioprozessen?

2. Was bedeutet Schubspannung? Eine Schubspannung wird in einem Körper durch ein Kräftepaar erzeugt. Die Kräfte greifen dabei an zwei parallelen Ebenen an und wirken in entgegengesetzter Richtung entlang der Ebenen. Der Körper wird dadurch seitlich geschert. 3. Wie wird Viskosität gemessen? Viskosität ist ein Maß für die innere Reibung. Viskosität kann nicht direkt gemessen, sondern muss berechnet werden. Sie steht – je nach verwendetem Messprinzip – mit bestimmten Messgrößen in Korrelation. So kann als Messgröße beispielsweise die Zeit verwendet werden, die eine fallende Kugel für eine bestimmte Strecke benötigt, um einen Wert für die Viskosität zu errechnen. Oder es wird als Messgröße der Widerstand verwendet, den die zu vermessende Substanz einem sich bewegenden Messkörper entgegensetzt. Die Messergebnisse können absolut oder relativ sein. Werden genormte Messgeometrien wie Platten, Kegel oder koaxiale Zylinder verwendet, so können die mit dem Messgerät erfassten Rohdaten in Absolute Einheiten umgerechnet werden. Sie sind somit vom Messsystem unabhängig und mit allen anderen absoluten Messergebnissen vergleichbar. Bei relativen Messgeometrien, z.B. Flügeldrehkörpern, lassen sich die genauen Scherdeformationen (und damit die Geometriefaktoren) nicht berechnen, und diese Ergebnisse sind nur unter Verwendung ähnlicher Geräte Messkörper und derselben Messprozedur miteinander vergleichbar. Trotzdem kommen diese Messgeometrien zum Einsatz, da sie oftmals die einzige Möglichkeit bieten, reproduzierbare Messungen durchzuführen. Die Viskosität ist nämlich keine Konstante, sondern von verschiedenen Parametern wie Temperatur, Druck, Schergeschwindigkeit oder zeitabhängig. 4. Welche Faktoren beeinflussen die Viskosität einer “Fermentationsbrühe” Rheologische Eigenschaften in Fermentationsbrühen: • Zellkonzentration • Zellmorphologie (Größe, Form, Masse) • Flexibilität / Deformierbarkeit von Zellen

• Osmotischer Druck auf suspendierende Flüssigkeit • Konzentration polymerer Substrate / Produkte • Scherrate

5. Erklären Sie wieso Mischen in Bioprozessen wichtig ist. Was wird gemischt? (Flüssigkeiten, Aufrechterhaltung von Suspensionen aus festen Partikel) - Wo?, (Gas-Dispersion, Wärmetransfer) - erkläre ● Mischen ist wichtig, um die Homogenität von Prozessparametern, wie Substrat-, Sauerstoff- oder CO2-konzentration im Reaktor aufrecht zu erhalten der Parameter ● gutes Mischen bedeutet Turbulenz (meiste Bioprozesse haben laminare Ströme) 6. Beschreibe einen Brau-Prozess in Verbindung mit dem Mischen (Siehe Scale-Up VL) ● es bestehen Inhomogenitäten beim Brauprozess ● Flüssigkeit wird zT durch CO2 Enstehung und Entweichung nach oben zirkuliert (abh. von Stoffwechselakt. und Tankform,-größe,-usw) ● Mischen durch CO2 meist nicht ausreichend um Inhomogenitäten im Brauprozess aufrecht zu erhalten (mech. Mischen hilft zb. Hefekonz. und Temp. aufrecht zu erhalten) ● insgesamt wichtig um: Fermentationszeiten zu verkürzen, Ester unterdrücken, mehr verwertbare Zucker in Ethanol umwandeln, reduzierte Abkühlzeiten nach Beenden von Ferm. ● Verwendung von RJM (Rotatory Jet Mixer) 7. Definition & Formel von: Reynolds-Zahl, Newton-Zahl, Froud Zahl ● Re: quantifiziert die Beziehung zwischen Mediumeigenschaften und Flow Charakteristika Formel: (siehe seminar) ● Ne: beschreibt dem Reaktor zugeführte Energie

Formel: ● Fr:

(siehe Seminar)

● 8. Definition: Energie-dissipations-Rate, Mischungs-Zeit, Ciculations-Zeit ● En.Dis.rate: Energy dissipation from turbulent kinetic energy into e.g. heat energy

Formel: x ● Mixing time: Zeit um ein gewissen Grad an Homogenität zu erreichen.

Abh. von Füllhöhe des Tanks und steigend mit größeren Prozessansätzen = größeren Reaktoren!!

Formel(n): und ● Zirkulationszeit: durchschnittliche Zeit eines Teilchens die Zirkulationsschleife zu durchlaufen. Zirkulationszeit ---> Verweilzeit Formel:

● 9. Diskutieren Sie rheologische Eigenschaften von Flüssigkeiten; Was sind newton´sche / nicht-newton´sch Flüssigkeiten (Wie verhalten Sie sich) ● new: linear viskoses Verhalten, will heißen, dass Schwergeschw. mit Scherspannung im linearen Zusammenhang; Bsp: Wasser, Luft ● non-new: nicht lineares Verhalten → Viskosität sinkt mit steig Schergeschw: strukturviskos oder Viskosität steigt mit steig. Schergeschw.: dilatant oder Bingham-Fluide: KETCHUP

10. Was ist der Weissenberg effect? 11. Erklären Sie die Unterschiede in Power draw für nicht vergaste und vergaste newton´sche Flüssigkeiten Ungassed Newtonian Fluids: - Abhängig von Rührergeschwindigkeit, Rührerdurchmesser, und Eigenschaften des Fluids ( Dichte und Viskosität)

P – Power, rho – Fluidichte, Ni – Rührergeschwindigkeit (versch), Di - Rührerdurchmesser

Gassed Newtonian Fluids: Gasblasen senken Dichte → Weniger Energie benötigt Gasgefüllte Hohlräume hinter Rührblättern senken Resistenz gegen Fluidfluss --> Aber Entstehen scheint willkürlich, deswegen schwierig zu bestimmen 12. Sie haben einen Tank, welches 10m hoch & 3m breit ist. Der Tank ist: ● ein bakterieller Prozess welches mit einem newton´sches Medium läuft ● ein Biogas-Prozess basierend auf landwirtschaftliche Abfälle (pflanzenbasiertes Material) ● ein Standard Brau-Prozess In allen Fällen möchten Sie ein gutes Mischen erreichen. Integrieren Sie Mixer & argumentieren Sie welch Rührer bzw, Mischung equipment sie verwenden, wo es eingebaut/ platziert wird & wie Sie sich für die vorgeschlagene Lösung entschieden haben.

13. Verstehen Sie das Diagramm: Reynolds gegen Newton-Zahl. Verstehe wo sie in diesem Diagramm laminare und turbnulenten Fluss/Strom zu finde ist. Was sagt ihnen das Diagramm?

● aus ökonomischer Sicht ist das wichtigste Kriterium die vom Rührer ins Medium eingebrachte Leistung ● Diagramm ist doppellogarithmische Auftragung von Re und New.zahl! ● Leistungseintrag hängt davon ab, ob laminare oder turbulente Strömung vorhanden und bevorzugt i turbulente Strömung, da in diesem Bereich ist die Newtonzahl, und damit Leistungseintrag, nahezu konstant! ● im Diagramm werden vesch. Rührer miteinander verglichen, abh. von Medium, Dichte, Viskosität (siehe Formeln Newton und Reynoldszahl) ● laminarer Bereich im linearen vorderen Teil ohne signifikante Mischung beider Stoffe (Zähigkeit wichtigstes Kriterium) ● Übergangsbereich mit zunehmender Turbulenz, aber nicht genauem math. Definition ● Turbulenter Bereich mit Newtonzahl unabhängig von Reynoldszahl und konstant!! (für jeden Rührertyp spezifisch!) ● Was sagt es aus?: Vermutlich, dass je nach Dichte und Viskosität bestimmte Rührer für Prozess besser geeignet sind als andere → wichtig ist, dass Turbulenz gesichert ist, da dort richtige Vermischung erst stattfindet, heisst, der Rührer am besten geeignet ist, der mit weniger Leistungseintrag eher zur Turbulenz führt irgendwann ist Reynoldszahl irrelevant, da Newtonzahl konstant

→ marine propeller führt zu turbulenz bei geringerem energieeintrag!

13. Diskutieren sie die folgenden Parameter in Verbindung zu dem Bioprozess scale up: Gas Transfer (O2, CO2), Wärmetransfer, Power draw, Variationen der lokalen spezifischen Energie-dissipations-Raten, Mischung der C-Quelle im Fed-Batch Prozessen 14. Erkennen Sie eine Rushton Turbine von verschiedenen Rührer Zeichnungen 15. Welche sind die Eigenschaften einer Rushton-Turbine? (Stromprofil, Power draw, Wieso werden ander Rührer manchmal bevorzugt?)

16. Erklären Sie die folgende Begriffe in verbindung zur Luft-Dispersion in Bioreaktoren: Flooded (geflutet), Loaded (geladen), Dispersed (Zerstreuung)

17. Erklären Sie die Kriterien welche für das Scale Up von Bioprozessen verwendet wird & dessen Eigenschaften (p/V. KLA, Spitzengeschwindigkeit, DOT Level) 18. Beschreiben Sie die Möglichkeiten, um Large-Scale Prozesse in Experimenten im Labormaßstab zu imitieren. Welche Methoden können sie verwenden & was die Unterschiede in Verbindung zum Large Sca ist? Methoden:

19. Erklären Sie was in einer Glucose Fütterungs Zone eines Groß-Reaktors geschehen könnte? (Beispiel:

Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae) Welche sind die Konsequenzen dieser Reaktionen für diesen Prozess?

Rekombinante Expression https://www.dropbox.com/sh/n0yl9evgvj8mcba/AABjpUKtT1LOn92tpjCqqWx2a/Bachelor/BVT%20I%20und%20II/BVT%20I weitere%20Unterlagen?dl=0&preview=vl1.pdf

1. Wie werden Plasmide stabilisiert ? Erklären Sie die Mechanismen der häufigsten Antibiotika (Ampicillin, Chloramphenicol, Tetracyclin, Kanamycin) die Stabilität des verwendeten Plasmids ist wichtig für eine erfolgreiche Expression ;Man unterscheidet 2 Arten von Plasmidstabilität: -Segregationelle Instabilität: Verlust des Plasmids durch fehlerhafte Zellteilung -Strukturelle Instabilität: Veränderung der Plasmidstruktur da Plasmidzellen mehr Bedarf an Synthesebausteinen für die Replikation, Transkription und Translation haben, weisen Plasmid zellen eine geringere Wachstumsrate als plasmidfreie Zellen auf, um dem entgegenzuwirken, werden Plasmide mittels verschiedener Mechanismen stabilisiert die meisten Stabilisierungssysteme haben keinen Einfluss auf die Plasmidteilung, sondern inhibieren das Wachstum Plasmid freier Zellen und üben positiven Selektionsdruck auf Plasmid enthaltende Zellen aus

stabilisation through : - resistance - partition site - suicide system ( hok/sok system) - complement

-

chromosomal integration

Aus der Dropbox: Plasmidstabilität: - Strukturelle Stabilität: Eine niedrige strukturelle Stabilität bezeichnet die häufig vorkommenden Änderungen in der Abfolge der Basensequenz aufgrund von Insertionen, Deletionen oder Punktmutationen Diese können zu hohen Verlusten bzw. Zu starker Produktinhomogenität bei der Herstellung rekombinante Proteine oder Plasmide führen. - Segregative Stabilität: Die Stabilität eines Plasmids in einer Population, also wie schnell die Zellen einer Kultur das Plasmid verlieren, wenn es nicht gebraucht wird. Methoden: Antibiotika-Resistenz, Partition site, Suicide system, Komplement, Chromosomale Integration

Mechanismen der Antibiotika: - Ampicillin: B-Lactam-Antibiotikum; gegen gram (+)-Bakterien, verhindert Ausbildung der Zellwand durch Bindung an Transpeptidase - Chloramphenicol: Translationshemmer; blockiert Peptidbindung (hemmt Peptidyltransferase-Aktivität) -Tetracyclin: verhindert die Anlagerung von tRNA in der 30-S-Untereinheit des Bakterien-Ribosoms; Translation und letzlich Proteinbiosynthese werden gestoppt -Kanamycin: Aminoglycosid-Antibiotikum; durchdringt die bakterielle Zellmembranen durch passive Diffusion oder durch (sauerstoffabhängigen) aktiven Transport; lagert sich an die 30-S-Untereinheit membranassoziierter Ribosomen an und hemmt damit die bakterielle Proteinsynthese. 2. Beschreiben Sie Promotoren welche zur Rekombinanten Gen Expression in Escherichia coli verwendet werden & wie die funktionieren (lambda  PL/PR, lac- abgeleitete Promotoren (lacUV5,tac), Arabinose P, T7 RNA-Pol. System) . 1.lambda PL/PR promoters from lambda phage -protein expression regulated by temperature-sensitive repressor -induction of protein expression is achieved by increasing the culture temperature,generally above 37 °C -as a result the temperature-sensitive repressor gets inactive, leaves the operator and gene expression starts -increase in temperature also causes a variety of complex stress responses 2.lac-derived promoters -induction of the lac-derived promoters is reached by addition of IPTG(isopropylthiogalactosid, structural analogon to allolactose -IPTG binds to the repressor, which leaves the operator, gene expression starts -IPTG is normally not degraded by the cell (in contrast to lactose) -a) lacUV5 promoter : mutant of lac promoter -usually the lac promoter has a binding site for a complex between the catabolite activator protein CAP(IPTG, Allolactose)and cAMP -this complex is necessary for RNA polymerase to bind to the promoter and initiate transcription -in lacUV5 this CAP-cAMP-promoter complex is no longer needed for transcription initiation :optimized expression -b) tac promoter: -the tac promoter was created by combining the tightly regulated lacUV5 operator with the trp (tryptophan) promoter, which is a very strong promoter -this hybrid promoter gives high-level expression utilizing the same induction and repression system as the lac promoter -although it is a highly active promoter, it has incomplete repression in the uninduced state, this is not problematic unless the expressed protein is toxic to the cell 3.ara promoter: induction of genexpression by arabinose -the arabinose promoter is part of a regulated expression system that is more complex than the lactose system. -the arabinose operon contains three genes (araB, araA, and araD) that encode enzymes that catalyze the conversion of arabinose to xyulose-5-phosphate, an intermediate of PPP that can be utilized to generate energy -these three genes are transcribed from the PBAD promoter -the araC gene encodes a transcriptional repressor that is transcribed from a second promoter (PC) that is divergent from PBAD The T7 RNA polymerase system:

-the gene of interest is removed from direct lac-mediated control -different to promoter, operator system -instead the gene of interest is cloned on a plasmid behind a promoter that is recognized by the viral T7 RNA polymerase (high activity) -T7RNAP is inserted into the host strain under lacUV5 control -the polymerase, controlled by lac, is inducible by IPTG -induction of the expression of polymerase leads to expression of the recomb. gene -protein yields in excess of 50% of total cellular protein can be obtained -this activity is so efficient, however, that it interferes with the production of essential cellular proteins and is finally toxic to the cell -for this reason, T7 strains should not be passaged or stored after induction

3. Verstehe die Kontrolle der Gen Expression auf transkriptioneller Ebene (Codon Usage, Coexpressio von tRNA´s, Zugänglichkeit ribosomische Bindungsstelle) - codon usage: individual codon usage per organism—> coexpression of rare tRNAs - accesibility of RBS: stable secondary structure of mRNA —> destabilization by sequence optimization/ high temperature —> start codon available Aus der Dropbox: Faktoren, die die Expression auf Translationslevel beeinflussen: - Stärke der Ribosom-binding-site (RBS) - Anzahl der mRNA-Moleküle, Stabilität der mRNA - Konzentration der Ribosomen und Translationsfaktoren - Energiezustand der Zelle - Codon Usage für das Zielgen - Länge des Gens Codon usage: - Alle Organismen nutzen den selben Code - in jeden Organismus werden bestimmte Codons öfter oder seltener verwendet als andere - Die entsprechende tRNA kommt demzufolge auch je nach Organismus häufiger oder seltener vor - Je nach codon usage kann es schwierig sein, Gene eines Organismus in einem anderen zu exprimieren (da die zu den Codons passenden tRNAs nicht vorhanden sind) - Lösung: Änderung der Codons über Gensynthese oder Überexpression bestimmter tRNAs Coexpression von tRNA: - Je nach tRNA-Vorkommen in den jeweiligen Spezies ist auch die Expression unterschiedlicher Proteine möglich Codon-Harmonisierungs-Strategien: - Änderung der Codons über Gensynthese - Überexpression bestimmter tRNAs

4. Beschreibe die Wirkungsweise von Chaperone (Wissen über HSP60 (GroEL/ES) & der HSP70 (DnaKJ GrpE) Systeme

Aus der Dropbox: Chaperone: - Chaperone (engl. Anstandsdame) sind Proteine, die neu synthetisierten Proteinen „helfen“, sich korrekt zu falten; es handelt sich nicht um ein Enzym (selber Protein). HSP60 (GroEL/ES): - HSP-Hitzeschockprotein - Chaperonsystem in den Zellen von Bakterien und Eukaryoten - Struktur und Funktion: Besteht auch Hsp60 in Mitochondrien und GroEL in Bakterien, Proteine, die in 7-gliedrige ringförmige „Fässer“ bilden, deren „Deckel“ und „Boden“ aus je 7 Molekülen Hsp10 bzw. GroES bestehen.

HSP70 (DnaKJ/GrpE): - Verantwortlich für die korrekte Faltung und Aktivierung vieler Proteine - Bindet an Aminosäureketten und verhindert, dass diese aggregieren, bevor sie ihre korrekte Struktur angenommen haben -> Verhindert Inclusion Bodies 5. Beschreiben Sie, wie Sie die Gene im Periplasma des E.coli exprimieren, kennen Sie die üblichen Signalpeptide & den Weg wie diese Peptide mit diesen ausgeschieden werden

Signalsequenzen: -Homolog: OmpA, STII, PhoA, beta-lactamase -Heterolog: alpha-amlyase, PelB, SpA (streptococcus protein A) -

-

Sec: transport of unfolded proteins to periplasm (hydrophobic core of 10 or more residues flanked b a positively charged NH2-terminal region and a hydrophilic COO-terminal region containing a consensus sequence for leader peptidase cleavage) Tat: Transport of folded proteins (In SS a characteristic 2-Arg- motive)

Aus der Dropbox: Periplasma und Cytoplasma: - Periplasma: oxidierte Bedingungen; die äußere Membran ist für Proteine Sekretion der Peptide mit Hilfe der Signalpeptide

6. Wie werden Fed-batch Prozesse zur rekombinanten Proteinproduktion mit E.coli ausgeführt? Beschrieben Sie es detailliert. Seien Sie darauf vorbereitet einen Graphen zu zeichnen (X, S, DOT, Acetat, µ, Produkt, qp ). Induktionszeitpunkt.

qP und P für Ind. 1  DropBox: 1) - Induktion (IPTG) der rekombinanten Genexpression nach Acetatverbrauch damit die Zellen nicht überfüttert werden, muss die Feeding Rate ab der Induktion an konstant gehalten werden (gestrichelte Lin F 1) oder

2) - Induktion (IPTG) der rekombinanten Genexpression am Punkt der höchsten Zelldichte 7. Was sind Einschlusskörperchen? -

insoluble protein aggregates, proteins in non native form, high densitiy good for purification

Aus der Dropbox: ) sind kleine, nach Anfärbung unter Einschlusskörperchen oder Proteinaggregate (engl. inclusion bodies dem Lichtmikroskop sichtbare Partikel im Inneren von Z  ellen. Sie bestehen aus Ansammlungen von zumei fehlerhaft oder unvollständig gefalteten Proteinen, die im Z  ellkern oder Z  ytoplasma ausfallen.

Protein-Expressionsprozesse https://www.dropbox.com/sh/n0yl9evgvj8mcba/AABjpUKtT1LOn92tpjCqqWx2a/Bachelor/BVT%20I%20und%20II/BVT%20I weitere%20Unterlagen?dl=0&preview=V4+Testfragen.docx

1. Warum ist die Hefe Pichia pastoris einer der günstigsten Wirte für die Produktion von heterologen Proteinen? - - - -

-

GRAS – Status , günstig Kultivierung bei hoher Zelldichte möglich Wächst auf Methanol : → günstiger als Glucose Eukaryot → Glykosylierung möglich Weniger Hypermannosylierung als bei S.cerevisae : - addition von Mannoseresten (bis zu 200), welche die Funktionsfähigkeit der Proteine beeinflussen können und unterscheiden sich somit von der humanen Glykolisierung → Allergie auslösend und kurze Halbwertzeit, da Proteine als “fremd” vom Immunsystem erkannt werden - Lösung: Humanisierung → humane Glykosylierungsmuster durchgeführt hohe Sekretionskapazität 22 g/L kein Overflow-Metabolismus und kein anaerober Metabolismus molekulargenetisch einfach manipulierbar keine Klumpenbildung, da flache Oberfläche 

2. Beschreiben Sie das Prinzipschema für ein Fed-Batch-Verfahren, bei dem die rekombinante Expression durch Methanol mit Pichia pastoris (anfängliche Wachstumsphase mit Glycerin) induziert wird. Erläutern Sie die verschiedenen Phasen im Detail. Zeichnen Sie ein Diagramm und beschreiben Sie die verschiedene

Phasen einer Fed-Batch-Fermentation der Hefe Pichia pastoris für die Herstellung eines rekombinanten Proteins mit dem AOX1-Promotor.

3. Beschreiben Sie den biochemischen Prozess der Methanolverwendung bei Pichia pastoris.

❖ MetOH wird ins Peroxisom aufgenommen und durch AOX (Alkoholoxidase) zu Formaldehyd (HCHO/CH2O) und Wasserstoffperoxid (H2O2) umgewandelt ➢ H2O2 wird durch Katalase (CAT) zu ungiftigem H2O und ½ O2 abgebaut ❖ Formaldehyd kann entweder über Glutathion (GSH) zur Energiegewinnung, übe...