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Benemérita Universidad Autónoma de Puebla PRÁCTICA 4. PUNTO ISOELÉCTRICO DE PROTEÍNAS ¿SE PUEDE DETERMINAR EL PUNTO ISOELÉCTRICO DE GELATINA Y CASEÍNA POR PRECIPITACIÓN? Introducción

Discusión

Propiedades dieléctricas del disolvente

PROTEÍNA: Biomacromoléculas formadas por cadenas de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y con un peso molecular mayor o igual a 5000g/mol. CLASIFICACION DE LAS PROTEÍNAS

La constante dieléctrica se define como la capacidad de mantener separados a iones de diferente carga, en este sentido el agua presenta la mayor constante dieléctrica lo que permite mantener en solución a las proteínas. La adición de solventes de menor capacidad de separación de iones hace que las proteínas precipiten. Se usan como agentes precipitantes solventes miscibles con el agua como Acetona y Etanol. Se debe trabajar a temperatura baja para evitar la desnaturalización de la proteína.

Hojas de seguridad

Proteínas conjugadas

Resultados

Caseína Tubo 1 0 Tubo 2 0 Tubo3 + Tubo 4 ++ Tubo 5 X Tubo 6 +++ Tubo 7 +++ Tubo 8 ++ Tubo 9 0

El ph de la caseína teórico es de 4.6 y ése dato es el que se consideró para la solución problema. Cuando al mililitro de solución problema se le añadió soluciones a ph ácido, hubo un cambio de ph que promovió la modificación de las cargas en la solución total. Ése cambio se presentó en forma de precipitación y conociendo el concepto de ph isoeléctrico, quiere decir que se igualaron el número de cargas; lo mismo que hay de protones existe de radicales hidroxilo, presentando la mínima solubilidad ya que no existe repulsiones electrostáticas en las moléculas. La cuestión es encontrar el valor de ése ph isoeléctrico, el cual se obtiene con la ecuación de Henderson-Hasselbach; una expresión utilizada en química para calcular el pH de una disolución reguladora, o tampón, a partir del pKa o el pKb (obtenidos de la constante de disociación del ácido o de la constante de disociación de la base); en éste caso utilizamos el pka del ácido acético que es 4.76 y de las concentraciones de equilibrio del ácido o base y de sus correspondientes base o ácido conjugado, respectivamente. En el primer caso, para utilizar la ecuación Henderson-Hasselbach nuestra solución problema es nuestra base del resultado de añadir caseína, hidróxido de sodio y aforarla con ácido acético al 0.1N obteniendo caseinato de sodio y nuestro ácido que son las soluciones de ácido acético a distintas concentraciones.

TUBO 1 TUBO 2 TUBO3 TUBO 4 TUBO 5 TUBO 6 TUBO 7 TUBO 8 TUBO 9

NIVELES ESTRUCTURALES DE LAS PROTEINAS CASEINA La caseína es una proteína de digestión lenta y rica en calcio con acción anti-catabólica en el cuerpo. PUNTO ISOELÉCTRICO: 4.6 Es uno de los principales componentes proteicos de la leche de origen animal, especialmente del ganado vacuno, representando aproximadamente el 80% del total de proteínas de la leche. Una característica distintiv a de la proteína de caseína es su insolubilidad a un pH bajo. Contiene aa. Esenciales, de los cuales destaca su elevado contenido de glutamina, la cual se le atribuye las propiedades beneficiosas en la musculatura y también a nivel de inmunidad de nuestro cuerpo.

TURBIDEZ 0 ++ ++ +++ +++ X ++ ++ 0

En la práctica el tubo 5 presentó precipitación y utilizando la fórmula obtenemos un ph de 4.76 el cual es muy cercano si lo comparamos con el pI de la caseína mostrando una congruencia con lo que se vió en el experimento. En el experimento de la gelatina, el ph resultante fue de 4.458 a comparación del punto isoeléctrico de la gelatina que es de 4.7. Esto ocurre porque en nuestra solución se agregó 6 mililitros de alcohol etílico, un solvente que no logra mantener la separación de los iones en nuestra solución provocando una precipitación pero en el caso de la gelatina, se reprodujo en una leve nebulosidad.

Conclusión Con los resultados obtenidos en los diferentes tubos en base a la presencia de turbidez, precipitación, con el uso de soluciones de concentración conocida y el empleo de la ecuación de Henderson Hasselbach, pudimos determinar los valores de pH en cada tubo, a que valor de pH se presentaban como solubles las proteínas y por lo tanto a que pH se presentaba el punto isoeléctrico. Igualmente observamos el uso del alcohol como agente precipitante en base en su solubilidad en dos compuestos distintos (agua y proteínas). Se puede determinar el punto isoeléctrico de la caseína, debido al cambio de pH cambiando la carga total de la proteína, así las cargas eléctricas son estables, presentando la mínima solubilidad, ya que no hay repulsión electrostática y provocando la precipitación. Se puede determinar el punto isoeléctrico de la gelatina, adicionando solventes de menos capacidad de separación de iones provocando que las proteínas se precipiten.

Cálculos Concentración de la solución problema

PUNTO ISOELECTRICO: Es el pH al que un polianfólito tiene carga neta cero. El concepto es particularmente interesante en los aminoácidos y también en las proteínas. A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. Para calcularlo se deben utilizar los pKa.

C=

C=

OBJETIVOS Se llama pH isoeléctrico o punto isoelectrico al pH en el que la concentración de Zwitterión es máxima (el aminoácido no presenta carga neta). Otra definición de punto isoelectrico es: pH al que la concentración de especies protonadas y desprotonadas se iguala. Cuando el número de cargas positivas se iguala con el número de cargas negativas se dice que la proteína se encuentra en su pH isoeléctrico y presenta el mínimo de solubilidad ya que no hay repulsión electrostática entre las moléculas.

1. 2.

C=

Determinar el pI de diferentes proteínas. Observar el efecto del alcohol como agente precipitante.

C=

C=

C=

C=

C=

C=

Las moléculas complejas, tales como las proteínas, se combinan con los iones hidrógeno y con otros iones presentes en la disolución, dando lugar a la carga neta de la molécula. A la concentración de iones hidrógeno, o al pH, para el cual la concentración del ion híbrido de una proteína es máxima y el movimiento neto de las moléculas de soluto en un campo eléctrico es prácticamente nulo, se le denomina punto isoeléctrico. GELATINA La gelatina es parte del gran grupo de los hidrocoloides. PUNTO ISOELÉCTRICO 4.7

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿)

-

18 tubos de ensaye. 2 gradillas. Pipetas de 1, 5 y 10 mL. Vaso de precipitado.

- Ácido acético: 0.01 N, 0.1 N, 1.0 N. - NaCl 1% - NaOH 10% - NaOH 1.0 N. - Acetato de sodio 0.1 N. Alcohol etílico y agua destilada

C=

C=

Desarrollo

Primer desarrollo

C=

Segundo desarrollo C=

pH El cambio de pH de la solución en que se encuentra la proteína promueve cambio en las cargas de los residuos y por lo tanto un cambio de carga total de la proteína. Cuando el número de cargas positivas se iguala con el número de cargas negativas se dice que la proteína se encuentra en su pH isoeléctrico (Punto isoeléctrico) y presenta el mínimo de solubilidad ya que no hay repulsión electrostática entre las moléculas.

Agregar a cada tubo el volumen correspondiente a las soluciones indicadas

Agregar 1 ml de la solución problema y agitar inmediatamente.

Agregar en cada tubo las soluciones indicadas por la práctica

Mezclar el contenido

Desechar con pipeta la mitad de cada uno

C=

C=

= 0.01

C=

= 0.01

C=

= 0.01

C=

= 0.01

C=

= 0.01

C=

= 0.01

C=

= 0.01

C=

Anotar resultados Esperar 15 minutos

"0"; falta de turbidez, "+" grados de turbidez y "X" precipitación.

Al tubo número 5 añadir de 5 a 8 ml de etanolhasta producir una leve nebulosidad.

Adicionar a los demás tubos la misma cantidad de alcohol añadida al tubo 5.

Anotar los reusltados de la misma forma que para la caseína

(0.1𝑁)(2𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

(0.1𝑁)(2𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

(0.1𝑁)(2𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

(0.1𝑁)(2𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

(0.1𝑁)(2𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

(0.1𝑁)(2𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

(0.1𝑁)(2𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

C=

El valor del pH isoeléctrico de una proteína determinada, puede variar dependiendo de la cantidad de iones presentes en la solución (aniones o cationes). Cuando se eliminan todos los iones diferentes a H+ o –OH se determina el llamado pH isoiónico y este no varía en la proteína específica. Se pueden separar proteínas usando precipitación por su punto isoeléctrico ya que cada proteína tiene un valor específico. Además las proteínas presentan su conformación nativa y es posible solubilizarlas en una solución con el pH adecuado.

= 0.01

(0.01 𝑁)(0.62𝑚𝐿)

pHsolución 0.01

= 6.2𝑥10−4

pH=4.76+log6.2𝑥10−4 = 5.807

(0.01 𝑁)(1.25𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

= 1.25𝑥 10−3

pH=4.76+log1.25𝑥10−3 = 5.66

(0.1𝑁)(0.25𝑚𝐿)

= 2.5𝑥10−3

pH=4.76+log2.5𝑥10−3 = 5.362

10𝑚𝐿

10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(0.5𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(1𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(2𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(4𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(0.1𝑁)(8𝑚𝐿) 10𝑚𝐿

(1𝑁)(1.6𝑚𝐿)

Concentración de solución de gelatina C=

C=

Fundamento

C=

10𝑚𝐿

0.01

1.- Defina pI de una proteína

0.01

= 5𝑥10−3

Cuestionario

0.01

pH=4.76+log5𝑥10−3 5.061

= 1𝑥10 −2

0.01 pH=4.76+log1𝑥10−2 = 4.76

= 0.02

pH=4.76+log0.02 = 4.458

= 0.04

pH=4.76+log0.04 = 4.157

= 0.08

pH=4.76+log0.08 = 3.856

= 0.16

pH=4.76+log0.16 = 3.55

R= Es cuando el número de cargas positivas se iguala con el número de cargas negativas, cuando se logra esta igualdad la proteína presenta el mínimo de solubilidad ya que no hay repulsión electrostática entre las moléculas.

0.01

2.- Escriba la ecuación de Henderson- Hasselbach

0.01

0.01

0.01

MATERIALES Y REACTIVOS

Los hidrocoloides son sustancias que se producen de sustancias proteínicas vegetales o animales o azúcares múltiples. Tienen la capacidad de hincharse y ligar el agua. Los hidrocoloides se utilizan para espesar, gelificar y estabilizar los alimentos. Aunque no todos los hidrocoloides reúnen todas estas propiedades, la gelatina si las tiene. La gelatina es una sustancia derivada del colágeno, una sustancia que constituye gran parte del tejido conectivo en los seres vivos. El colágeno es una molécula de naturaleza proteica, es decir que está formada en base a aminoácidos. Está formada por 3 cadenas de aminoácidos, también llamados monómeros de tropocolágeno enlazados en forma de hélice. Esto debido a los enlaces de hidrogeno que se encuentran dentro de las cadenas

10𝑚𝐿

Concentración del tubo

= 0.01

C=

(0.1𝑁)(2𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

(0.1𝑁)(2𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

= .025

= .025

Concentración de los tubos

C=

C=

= .025

C=

= .025

C=

(.1𝑁 )(.12𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

(.1𝑁 )(.25𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

(.1𝑁 )(.5 𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

C=

= .025

C=

= .025

C=

= .025

C=

= .025

C=

= 3.125𝑥10 −3

= 6.25𝑥 10

(.1𝑁)(1𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

= .025

= 1.5𝑥10−3

(.1𝑁)(2𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

(.1𝑁)(4𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

8𝑚𝐿

6.25 𝑥10 −3

= 5.36

0.025

= 0.025

pH=4.7+log 0.025 = 4.76

= 0.05

pH=4.7+log 0.05 = 4.458

= 0.1

= 0.2

(.1𝑁)(3.2𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

pH=4.7+log

0.025

pH=4.7+log 0.0125 = 5.061

(.1𝑁)(1.6𝑚𝐿)

= 0.4

Donde:

0.025

pH=4.7+log 3.125𝑥10−3 = 5.66

= 0.0125

(.1𝑁)(0.8𝑚𝐿) 8𝑚𝐿

−3

pHgelatina 0.025

pH=4.7+log 1.5𝑥10−3 = 5.816

0.025

0.025

pH=4.7+log

pH=4.7+log

0.025 0.1

0.025 0.2

pH=4.76+log

= 4.157

S es la sal o especie básica, y



A es el ácido o especie ácida

3.- ¿Por qué el alcohol actúa como agente precipitante para la gelatina? R = La gelatina, es una mezcla heterogénea de proteínas, de alto peso molecular, todas son proteínas solubles en agua, y el agua está incorporada dentro de las moléculas individuales de los aminoácidos, lo que hace su carácter de gel. Al agregar suficiente alcohol etílico, se rompen las uniones de las moléculas, pues el agua se mezcla con el alcohol, y las proteínas precipitan, además de no ser solubles en alcohol.

= 3.856

0.025 0.4



= 3.55

Bibliografía Ayudas didácticas www.farmacopea.org.mx/Repositorio/Documentos/110.pdf...