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TRANSPORTE DE GLUCOSA A TRAVÉS DE MEMBRANA PLASMÁTICA Práctica 1

Estudio del efecto de los inhibidores/desacoplantes de la cadena de transporte de electrones.

María Forteza Guillot y Javier Lázaro Mora Bioquímica II

ÍNDICE Introducción ................................................................................................................................. 2 Objetivos ....................................................................................................................................... 2 Materiales y métodos .................................................................................................................. 3 EXPERIMENTO 1 (control) ......................................................................................................... 3 EXPERIMENTO 2 (DINITROFENOL) ............................................................................................ 3 EXPERIMENTO 3 (AZIDA) ........................................................................................................... 3 Resultados .................................................................................................................................... 4 Análisis de resultados................................................................................................................ 6 Discusión ..................................................................................................................................... 11 Cuestiones ............................................................................................................................... 11 Conclusión .................................................................................................................................. 13 Bibliografía ................................................................................................................................. 13

1

Introducción Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que se dividen por gemación. En comun  con otras celulas  eucariotas, las levaduras tienen un nucleo  en donde reside la información genética de la celula,  mitocondrias en donde se lleva a cabo la si  ntesis de ATP y un retículo endoplásmico y aparato de Golgi que se encargan de la si  ntesis de proteínas cuya localizacion  final es la membrana plasmatica  o el exterior. Presentan una complejidad superior a las bacteria pero compartiendo con ellas muchas de sus ventajas técnicas, como la manipulacion por ausencia total de patogenicidad. A nivel de la membrana plasmatica,  las levaduras tienen una ATPasa de H+ que acopla la hidrolisis del ATP con el bombeo de protones hacia el exterior de la celula. Este complejo es semejante desde un punto de vista estructural y funcional a la Bomba de Na+/K+ de las celulas animales y, al igual que la bomba de sodio/potasio, se inhibe con concentraciones micromolares de vanadato. Como resultado de la actividad de la ATPasa de H+ en la levadura, se genera un gradiente electroqui m  ico de protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al interior de la celula,  proceso catalizado por sistemas de transporte llamados simportadores o uniportadores. La H+ -ATPasa es la responsable de la formación del gradiente electroquímico de la membrana plasmatica.  Su actividad correlaciona con el crecimiento celular y se activa, principalmente, por glucosa. Para darse una idea de la importancia de esta enzima en la economi a celular y en la energización de la membrana celular, basta decir que la ATPasa de H+ consume hasta un 25% del ATP que se sintetiza en la celula. Ademas de esta ATPasa de H+ de la membrana plasmatica, las levaduras tienen otra bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP sintasa, que se encarga de la síntesis del ATP. En contraste con la enzima de membrana plasmatica,  el flujo de protones a través de la ATP sintasa induce la síntesis de ATP. Uno de los inhibidores más efectivos de esta enzima es la oligomicina. De esta manera se puede determinar uno de los muchos ciclos en los que interviene el ATP en la levadura: por un lado, el ATP se sintetiza en la mitocondria por medio de la ATP sintasa, y a nivel de la membrana plasmática, la ATPasa de H+ lo hidroliza para bombear protones al exterior de la célula. El factor común en ambos casos es un flujo de protones a través de la membrana.

Objetivos 1. Que el alumno relacione el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las levaduras. 2. Que el alumno describa las vías por las cuales la glucosa genera los cambios de pH. 3. Que el alumno interprete el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre la salida de protones.

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Materiales y métodos ● ● ● ● ● ● ● ● ●

Vaso de precipitado de 100 ml. Pipetas de 5 y 10 ml. Micropipetas. pH-metro. Levadura (Saccharomyces cerevisiae) 200 mg/ml. Solución de glucosa (10%) para una concentración final de 1%. Solución de dinitrofenol 40 mmol/l en etanol. Solución de azida de sodio 400 mmol/l. Agua destilada.

EXPERIMENTO 1 (control) 1. 2. 3. 4.

Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 5 minutos para obtener la línea basal. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar y medir el pH. Determinar el pH de la solución cada 5 minutos 4 veces, y luego cada 10 minutos 2 veces más.

EXPERIMENTO 2 (DINITROFENOL) 1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada. 2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.2 ml de la solución de dinitrofenol 40 mmol/l, concentración final de 200 μmol/l. 3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal. 4. Esperar 5 minutos. 5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.

EXPERIMENTO 3 (AZIDA) 1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada. 2. Añadir por decantación (no pipetear) 0.5 ml de la solución de azida de sodio 400 mmol/l, concentración final de 5 mmol/l. Agitar con cuidado. 3. Determinar el pH de la solución y repetir la medición dos veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal. 4. Esperar 5 minutos. 5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.

3

Resultados Tiempo (min) 0 5 10 15 20 30 40

ph Glucosa Dinitrophenol Azida sodica 5.10 5.08 5.11 5.20 5.22 5.23 5.5 5.8 5.7 (5.09) (5.21) (5.6) 5.33 5.3 5.35 4.73 4.74 4.76 5.94 5.99 5.98 (5,32) (4.74) (5.97) 5.48 5.45 5.49 4.66 4.67 4.69 5.99 6.02 6.03 (5,47) (4.67) (6.01) 4.83 4.81 4.82 4.66 4.68 4.69 5.85 5.89 5.88 (4,82) (4.67) (5.87) 4.73 4.74 4.76 4.74 4.75 4.76 5.75 5.82 5.80 (4,74) (4.75) (5.79) 4.88 4.89 4.88 4.88 4.92 4.90 5.63 5.68 5.67 (4,88) (4.90) (5.66) 5.03 5.04 5.05 5.02 5.03 5.04 5.64 5.60 5.63 (5,04) (5.03) (5.62) Tabla 1: Medidas y medias del pH calculado por tiempo.

Tiempo (min.)

Media Glucosa

Desviación Glucosa

Error tipo

0

5.09

0.0125

0.0153

5

5.32

0.0205

0.0005

10

5.47

0.0170

0.0208

15

4.82

0.0082

0.01

20

4.74

0.0125

0.0153

30

4.88

0.0047

0.0058

40

5.04

0.0082

0.01

Tabla 2: Medidas del pH de la glucosa.

Tiempo (min.)

Media DNP

Desviación DNP

Error tipo

0

5.21

0.0125

0.0153

5

4.74

0.0125

0.0153

10

4.67

0.0125

0.0153

4

15

4.67

0.0125

0.0153

20

4.75

0.0082

0.01

30

4.90

0.0163

0.02

40

5.03

0.0082

0.01

Tabla 3: Medidas del pH del Dinitrofenol.

Tiempo (min.)

Media Azida sódica

Desviación Azida sódica

Error tipo

0

5.6

0.1247

0.1528

5

5.97

0.0216

0.0265

10

6.01

0.0170

0.0208

15

5.87

0.0170

0.0208

20

5.79

0.0294

0.0361

30

5.66

0.0216

0.0265

40

5.62

0.0170

0.0208

Tabla 4: Medidas del pH de la azida sódica.

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Análisis de resultados 1. Hacer una gráfica de cada uno de los experimentos; utilizando los valores de las lecturas de pH vs tiempo.

Gráfica 1: ph Glucosa vs Tiempo.

Gráfica 2: ph Glucosa vs Tiempo con barras de error.

6

Gráfica 3: ph Dinitrophenol vs Tiempo.

Gráfica 4: ph Dinitrophenol vs Tiempo con barras de error.

7

Gráfica 5: pH Azida sódica vs Tiempo.

Gráfica 6: pH Azida sódica vs Tiempo con barras de error.

8

2. Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control, con dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio. Normalización pH

Tiempo (min.)

Glucosa

Dinitrofenol

Azida sódica

0

0.93

1

0.93

5

0.97

0.90

0.99

10

1

0.89

1

15

0.88

0.89

0.97

20

0.86

0.91

0.96

30

0.89

0.94

0.94

40

0.92

0.96

0.93

Tabla 5: Normalización del pH.

ΔPh1 ΔPh2 ΔPh3 Medias Control

0.75

0.67

0.81

0.76

DNP

0.58

0.54

0.64

0.58

Azida de sodio

0.34

0.06

0.1

0.16

Tabla 6: Incrementos y medias de los distintos pH.

Extrusión de protones (%)

Inhibición (%)

Control

100

0

DNP

76.31

23.69

Azida de sodios

21

79

Tabla 7: Extrusión e inhibición de protones. 9

Gráfica 7: Extrusión e inhibición de protones. Con esta gráfica lo que se demuestra es que el grupo control no inhibe nada, el DNP inhibe un 24% aprox. y la azida de sodio inhibe un 79% la extrusión de protones. Por tanto, el DNP que actúa como desacoplante, creará agujeros en la membrana haciendo así que la célula no pueda trabajar. Y por su parte, la azida de sodio es un inhibidor de la cadena de transporte electrónico por lo que no va a poder producir ATP.

3. Hacer una relación de las vías que producen estos cambios; tomar en cuenta que las levaduras poseen una ATPasa de protones en la membrana mitocondrial que se encarga de sintetizar ATP y que tienen otra ATPasa de protones en la membrana plasmática cuya función es similar a la bomba de Na+/K+ en las células de los mamíferos. Ambas vías se sitúan en membranas, empleando un mecanismo similar pero con distinta finalidad. La disminución de producción de ATP mitocondrial afecta al transportador de glucosa, que utiliza ATP para bombear protones. El ATP es sintetizado en la mitocondria por la ATP sintasa, y posteriormente es hidrolizado para bombear protones al exterior por medio de ATPasa de H+. El factor común en ambos casos es un flujo de protones a través de la membrana. Al inhibir la producción de ATP en la mitocondria, el nivel energético celular baja y se inhibe la extrusión de protones acoplada a la entrada de glucosa. La ATPasa de protones de la membrana mitocondrial, necesita de la cadena de transporte electrónico para generar un gradiente de protones; por el contrario, la ATPasa de la membrana plasmática no requerirá un proceso tan complejo como el de la cadena. La energía producida en ambas finalmente será invertida en distintos procesos.

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Discusión Cuestiones 1. ¿Cuáles son las fuentes de carbono que usa la levadura? Entre los azúcares que puede utilizar están fructosa, manosa o galactosa. También son capaces de utilizar disacáridos como la maltosa y la sacarosa y trisacáridos como la rafinosa. Como otros muchos seres vivos, las levaduras o. De este modo, en presencia de una amplia gama de fuentes de carbono diferentes en las que esté presente la glucosa, su metabolismo se adapta a catabolizar prioritariamente la glucosa.

2. ¿Cuáles son las vías metabólicas que catabolizan a los carbohidratos?

3. ¿En qué consisten la glucólisis y la fosforilación oxidativa? , también conocida como glicólisis, es

r. Es

una . En esta vía reacciones mediadas por enzimas. Es una E

. Consta de a.

La fosforilación oxidativa es la . Es el , tras la glucólisis y el ciclo del ácido cítrico. Este proceso metabólico está formado por un conjunto de enzimas complejas, ubicadas en la membrana interna de las mitocondrias, que catalizan varias

4.

¿En qué consiste la fermentación alcohólica? Denominada también como fermentación del etanol o fermentación etílica, es un

. Este proceso tiene como finalidad biológica

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5. ¿Cuáles son los inhibidores de la cadena respiratoria de los sitios I, II y III? Describa su efecto sobre el consumo de O2 y la síntesis del ATP. Los inhibidores de la cadena de transporte de electrones . Son sustancias que , a la vez que Inhibidores del complejo I NADH-UQ OXIDOREDUCTASA: ➢ Rotenona: afectaba a la cadena respiratoria de los peces y estos morían y flotaban en la superficie. ➢ barbitúrico. ➢ Pieredicina: antibiótico. ➢ Amobarbital: barbitúrico. Inhibidores del complejo II Succinato deshidrogenasa: ➢

inhibidor competitivo de la succinato Dh.

Inhibidores del complejo III: a: antibiótico de hongos producido por Streptomyces griseous, bloquea la cadena respiratoria en el paso entre el citocromo b y el citocromo c1. ➢ Mixotiazol: se llama “inhibidor proximal”. ➢

6. ¿Cuál es el mecanismo por medio del cual los protonóforos desacoplan la fosforilación oxidativa? Describa su efecto sobre el consumo de O2 y la síntesis del ATP. Un protonóforo es un ionóforo (molécula soluble en lípidos para transportar iones a través de una bicapa lipídica de membrana celular) que se encarga de mover protones sin la necesidad de un canal de transporte. La forma en la que desacoplan la fosforilación oxidativa es la forma aniónica del protonóforo, que se absorbe sobre el lado cargado positivamente de la bicapa lipídica. Los protonóforos tienen como función disociar la oxidación de la cadena

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Conclusión Para concluir con esta memoria de la práctica 1, observamos que para averiguar si los inhibidores y los desacoplantes funcionan se utiliza glucosa porque las levaduras realizan la glucólisis y, de este modo, reducen moléculas que después donarán esos electrones y se creará una fuerza protón motriz, por lo que se deben medir los cambios de pH. Los desacoplantes de membrana dañan la relación entre la cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa y hacen la función de ácidos lipofílicos débiles, que se asocian con protones en el exterior de la mitocondria, permitiendo el paso de electrones pero no la formación de ATP (ya que los protones translocados no regresan a la matriz mitocondrial a través de la ATP sintasa.)

Bibliografía Perfil, V. (2017). Glucólisis. [Online] Ibcbioquimica.blogspot.com.es. Available at: http://ibcbioquimica.blogspot.com.es/2012/04/glucolisis.html [Accessed 21 Oct. 2017]. Perfil, V. (2017). Fosforilación Oxidativa. [Online] Lucero-bioqumica.blogspot.com.es. Available at: http://lucero-bioqumica.blogspot.com.es/2009/04/fosforilacion-oxidativa.html [Accessed 21 Oct. 2017]. Ecured.cu. (2017). Fermentación alcohólica - EcuRed. [Online] Available at: https://www.ecured.cu/Fermentaci%C3%B3n_alcoh%C3%B3lica [Accessed 21 Oct. 2017].

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