Catena di trasporto degli elettroni PDF

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Catena di trasporto degli elettroni e fosforilazione ossidativa associate alla produzione di ATP...

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Il trasporto degli elettroni e la fosforilazione ossidativa: nelle cellule eucariotiche, i processi aerobici (compresa la conversione di piruvato in acetil-CoA, il ciclo dell'acido citrico e il trasporto degli elettroni) avvengono tutti nei mitocondri, mentre il processo anaerobico, la glicolisi, avviene al di fuori dei mitocondri, nel citosol. Le reazioni della catena di trasporto degli elettroni avvengono nella membrana mitocondriale interna. Perché la struttura mitocondriale è importante nella produzione dell'ATP? La produzione di ATP nei mitocondri è il risultato della fosforilazione ossidativa, in cui l'ADP è fosforilato ad ATP. La produzione di ATP (processo endoergonico) è distinta dal trasporto degli elettroni all'ossigeno (processo esoergonico), ma le reazioni della catena di trasporto degli e- sono fortemente legate una all'altra e sono strettamente accoppiate alla sintesi di ATP. L'attività della catena di trasporto porta a pompare protoni attraverso la membrana mitocondriale interna, creando un gradiente di pH, il gradiente protonico, che rappresenta energia potenziale immagazzinata e fornisce le basi del meccanismo di accoppiamento (accoppiamento chemiosmotico). Le molecole di NADH e FADH2 ottenute nella glicolisi e nel ciclo dell'acido citrico trasferiscono gli e - all'ossigeno nella serie di reazioni definite globalmente catena di trasporto degli elettroni. NADH e FADH2 sono ossidati a NAD + e FAD e possono essere riutilizzati in diverse vie metaboliche; l'ossigeno è l'accettore ultimo degli elettroni ed è ridotto ad acqua e ciò completa il processo mediante il quale il glucosio è ossidato completamente ad anidride carbonica ed acqua. Schema generale del processo: NADH e FADH2 cedono elettroni al coenzima Q; gli elettroni sono quindi trasferiti dal coenzima Q ad una serie di proteine chiamate citocromi fino ad arrivare all'ossigeno. I potenziali di ossido-riduzione nella catena di trasporto degli elettroni: considerando le variazioni di energia del trasporto degli elettroni, un approccio più utile è quello di considerare la variazione di energia associata al movimento degli elettroni da un trasportatore ad un altro. Prendendo in considerazione due trasportatori di elettroni, come il NADH e il coenzima Q, per esempio, come potremmo sapere se gli e- verranno trasferiti con maggiore probabilità dal NADH al coenzima Q o viceversa? Questo può essere determinato con la misura di un potenziale di ossido-riduzione per ognuno dei trasportatori. Una molecola con potenziale di ossido-riduzione elevato tenderà ad essere ridotta se accoppiata ad una molecola con potenziale di ossido-riduzione più basso. Organizzazione dei complessi di trasporto degli elettroni: i mitocondri intatti, isolati dalle cellule, possono effettuare tutte le reazioni della catena di trasporto degli elettroni. Ci sono 4 complessi della catena respiratoria, essi rappresentano dei sistemi multienzimatici. Quali reazioni avvengono nei complessi respiratori? Complesso I – NADH-CoQ ossidoreduttasi catalizza il trasferimento di elettroni dal NADH al coenzima Q (CoQ). Questo complesso è parte integrale della membrana mitocondriale interna ed include tra le sue subunità (superiori a 20 in totale) molte proteine che contengono centri ferro-zolfo e la flavoproteina (possiede un coenzima flavinico, chiamato flavin mononucleotide, o FMN, che differisce dal FAD per la mancanza del nucleotide adenilico) che ossida il NADH. La reazione avviene in varie tappe: 1) trasferimento di elettroni dal NADH alla porzione flavinica della flavoproteina (FMN); 2) la flavoproteina ridotta è riossidata e la forma ossidata della proteina ferro-zolfo è ridotta; 3) la proteina ferro-zolfo ridotta dona i suoi elettroni al coenzima Q, che si riduce a CoQH2; il coenzima Q è anche chiamato ubichinone. Questa reazione è una delle tre responsabili del pompaggio di protoni, è fortemente esoergonica e rilascia abbastanza energia da permettere la fosforilazione dell'ADP a ATP. Riguardo la pompa elettronica e il trasporto di elettroni, è importante considerare le sottili differenze che ci sono tra i diversi trasportatori di elettroni. Nonostante tutti possano esistere in forma ossidata/ridotta, c'è un ordine secondo il quale alcuni avranno la tendenza a ridurre gli altri (NADH dona i suoi e- a CoQ, ma non avviene l'inverso); esiste una direzione del flusso di elettroni. Alcuni trasportatori, come il NADH, trasportano elettroni e idrogeno in forma ridotta, mentre altri, come la proteina ferro-zolfo, possono trasportare solo elettroni. Questa è la base della pompa protonica: l'architettura della membrana interna del mitocondrio e dei trasportatori di e- consente agli ioni idrogeno di passare dalla parte opposta della membrana. Il recettore finale del complesso, il CoQ, è mobile, cioè libero di muoversi nella membrana e di cedere gli elettroni che ha acquistato al terzo complesso, per il trasporto ulteriore verso l'ossigeno. Vedremo ora come un secondo complesso trasferisce anch'esso gli e- da un substrato ossidabile a CoQ. Complesso II – succinato-CoQ ossidoreduttasi tutto il complesso è parte integrale della membrana mitocondriale interna; in questo caso il substrato è il succinato, che fa parte del ciclo dell'acido citrico, e la fonte di elettroni è il FAD: 1) succinato è ossidato a fumarato da un enzima flavinico (enzima succinato deidrogenasi fa parte di questo complesso enzimatico); 2) il gruppo flavinico è riossidato, mentre un'altra proteina ferro-zolfo viene ridotta; 3) la proteina ferro-zolfo ridotta dona i suoi elettroni al coenzima Q ossidato ed il coenzima Q è ridotto. La reazione è esoergonica, ma non libera abbastanza energia da produrre ATP e gli ioni idrogeno non sono pompati al di fuori della matrice in questa reazione.

Nelle tappe successive della catena di trasporto degli elettroni, gli e- sono ceduti dal CoQ, che è quindi riossidato, alla prima di una serie di proteine molto simili, chiamate citocromi. Ognuna di queste proteine contiene un gruppo eme, ed in ogni gruppo eme il ferro è ridotto ciclicamente a Fe(II) e riossidato a Fe(III); ogni proteina differisce di poco dalle altre in struttura e ciò conferisce ad esse proprietà leggermente differenti, compresa la tendenza a partecipare alle reazioni di ossido-riduzione. I tipi diversi di citocromi sono contraddistinti da lettere minuscole (a, b, c). Complesso III – CoQH2-citocromo c ossidoreduttasi o citocromo c reduttasi catalizza l'ossidazione del CoQ e gli elettroni prodotti in questa reazione di ossidazione sono trasferiti al citocromo c in un processo a più tappe. L'ossidazione del CoQ coinvolge due e-, mentre la riduzione di Fe(III) a Fe(II) richiede un solo e-. Quindi sono necessarie due molecole di citocromo c per ogni molecola di CoQ. I componenti di questo complesso includono il citocromo b (nello specifico due citocromi del tipo b, bH e bL), il citocromo c1 e molte proteine ferro-zolfo; il complesso è parte integrale della membrana mitocondriale interna. I citocromi possono trasportare e- ma non ioni idrogeno; questo è un altro sito dove gli ioni idrogeno lasciano la matrice, quando CoQH2 è ossidato a CoQ, gli ioni idrogeno passano nello spazio intermembrana. Il coenzima Q e il citocromo c, possono muoversi liberamente nella membrana mitocondriale interna (non appartengono propriamente ai complessi della catena respiratoria. Il citocromo c non fa parte del complesso, è debolmente legato alla superficie esterna della membrana mitocondriale interna, rivolto verso lo spazio intermembrana); gli stessi complessi della catena respiratoria si muovono all'interno della membrana e il trasporto di e- avviene quando un complesso, spostandosi, incontra il complesso successivo della catena. Ciclo Q: il flusso degli e- dal coenzima Q ridotto agli altri componenti del complesso non compie un percorso semplice e diretto. È sempre più evidente un flusso ciclico di elettroni che coinvolge per due volte il CoQ. Questo comportamento dipende dal fatto che CoQ può esistere in tre forme, tra le quali la forma semichinonica, intermedia tra la forma ossidata e ridotta, è qui di cruciale importanza. 1) un elettrone è fatto passare dal CoQH2 ridotto ai centri ferro-zolfo e poi al citocromo c1, lasciando il CoQ nella forma semichinonica >> CoQ- anione semichinonico; 2) il semichinone partecipa ad un processo ciclico nei quali i due citocromi b, bL e bH, sono a turno ridotti e ossidati; è coinvolta anche una seconda molecola di coenzima Q, che trasferisce un secondo elettrone al c1 e di qui al trasportatore mobile citocromo c. Una molecola di CoQH2 è riformata ed una è ossidata a CoQ. Il risultato delle reazioni di questo complesso è il pompaggio di protoni al quale è accoppiata la produzione di ATP. Complesso IV – citocromo c ossidasi la citocromo ossidasi (circa 10 subunità) è parte integrale della membrana mitocondriale interna e contiene i citocromi a ed a3, oltre a due ioni Cu2+ che partecipano al processo di trasporto. Gli ioni rame sono accettori intermedi di elettroni che si trovano tra i due citocromi del tipo a nella sequenza: Cit c → Cit a → Cu2+ → Cit a3 → O2 la reazione complessiva catalizzata dalla citocromo c ossidasi è: 2 Cit c [Fe(II)] + 2H+ + ½O2 → 2 Cit c [Fe(III)] + H2O I citocromi a ed a3 insieme formano il complesso chiamato citocromo ossidasi. La citocromo ossidasi ridotta è poi ossidata dall'ossigeno, che a sua volta è ridotto ad acqua. Anche in questo stadio il trasporto di elettroni è accoppiato alla produzione di ATP attraverso la pompa di protoni. Qual è la natura delle proteine del trasporto degli elettroni che contengono ferro? I citocromi sono macromolecole presenti in tutti gli organismi, siti tipicamente nelle membrane; negli eucarioti, sono proteine integrali della membrana mitocondriale interna, ma possono trovarsi anche nel RE. Tutti i citocromi contengono il gruppo eme, tuttavia nei citocromi il ferro del gruppo eme è coinvolto nella serie di reazioni redox e non trasporta ossigeno. Le ferro-proteine non-eme non contengono un gruppo eme, molte invece contengono zolfo (il ferro è legato in genere alla cisteina e allo zolfo). Collegamento fra il trasporto di elettroni e la fosforilazione: la fosforilazione di una mole di ADP richiede 30,5 kJ = 7,3 kcal. Le reazioni di ossidazione che generano energia generano un pompaggio di protoni e quindi un gradiente di pH tra i due lati della membrana mitocondriale interna. Oltre al gradiente di pH esiste una differenza di voltaggio tra i due lati della membrana generato dalle differenze di concentrazione degli ioni all'interno e all'esterno. L'energia del potenziale elettrochimico (differenza di voltaggio) attraverso la membrana è convertita nell'energia chimica dell'ATP attraverso un processo di accoppiamento. Qual'è il fattore di accoppiamento nella fosforilazione ossidativa? È necessario un fattore di accoppiamento per collegare l'ossidazione con la fosforilazione. Questa funzione è svolta da una proteina oligomerica complessa, distinta dai trasportatori di elettroni; la proteina completa attraversa la membrana mitocondriale interna per tutto il suo spessore e protrude anche nella matrice. La porzione della proteina che attraversa la membrana è chiamata F0 e consiste di 3 catene polipeptidiche diverse (a, b e c). La porzione che protrude nella matrice è chiamata F1 e consiste di 5 catene polipeptidiche diverse, nel rapporto α3β3 γ δ ε; rappresenta il sito della sintesi di ATP.

L'intero complesso proteico è chiamato ATP sintasi ed è anche conosciuto come ATPasi mitocondriale, perché l'enzima può catalizzare sia la fosforilazione che la reazione inversa di idrolisi dell'ATP. Composti conosciuti come disaccoppianti inibiscono la fosforilazione dell'ADP senza influire sul trasporto degli elettroni: un noto esempio è il 2,4 dinitrofenolo (anche molti antibiotici come valinomicina e la gramicidina A); quando è presente un disaccoppiante, l'ossigeno è ancora ridotto ad H 2O, ma non si produce ATP. Se il disaccoppiante viene rimosso, si ristabilisce la sintesi di ATP legata al trasporto degli elettroni. Un termine detto rapporto P/O è usato per indicare l'accoppiamento della produzione di ATP con il trasporto degli elettroni: fornisce il numero di moli di Pi consumate nella reazione ADP + Pi → ATP, per ogni mole di atomi di ossigeno consumata nella reazione ½ O2 + 2H+ + 2 e- → H2O Quando il substrato ossidato è il NADH vengono prodotte 2,5 moli di ATP e 1 atomo di ossigeno viene ridotto per ogni mole di NADH ossidato; rapporto P/O = 2,5 quando il substrato ossidato è il NADH. Quando il substrato ossidato è FADH2 il rapporto P/O = 1,5 Meccanismo di accoppiamento durante la fosforilazione ossidativa: l'accoppiamento chemiosmotico è stato il primo meccanismo proposto per spiegare l'accoppiamento tra trasporto di elettroni e produzione di ATP, dopodiché esso è stato modificato per includervi un'ipotesi di accoppiamento conformazionale. Che cos'è l'accoppiamento chemiosmotico? Il punto cruciale è il gradiente di protoni tra i lati della membrana mitocondriale interna (ipotizzato per la prima volta nel 1961 dall'inglese Peter Mitchell. Il gradiente esiste perché le diverse proteine che hanno la funzione di trasportatori di elettroni nella catena respiratoria non sono orientate simmetricamente rispetto ai due lati della membrana mitocondriale interna, né reagiscono allo stesso modo rispetto alla matrice e allo spazio intermembrana (complesso I/III trasportano rispettivamente 4H+, complesso IV trasporta 2H+; il numero di H+ è incerto e fonte di controversie). Nel meccanismo di trasporto degli elettroni, le proteine dei complessi della catena respiratoria acquistano i protoni dalla matrice per trasferirli nelle reazioni redox e rilasciarli nello spazio intermembrana. Il risultato è che c'è una concentrazione maggiore di protoni nello spazio intermembrana che nella matrice; quando i protoni rifluiscono nella matrice avviene la produzione di ATP. Accoppiamento chemiosmotico: -per la fosforilazione ossidativa è essenziale un sistema con compartimenti interni/esterni ben definiti (vescicole chiuse); -è possibile costituire un sistema modello della fosforilazione ossidativa con la pompa protonica, in assenza del trasporto degli elettroni. Il sistema consiste di vescicole di membrana, ATP sintasi mitocondriale e una pompa di protoni (nel caso specifico la pompa è la batteriorodopsina, una proteina che si trova nelle membrane degli alobatteri; la pompa funziona quando la proteina è esposta alla luce); Il modo in cui il gradiente protonico porta alla produzione di ATP dipende dai canali ionici che attraversano la membrana mitocondriale interna, caratteristici dell'ATP sintasi. I protoni rifluiscono verso la matrice attraverso F0 e questo processo è accoppiato alla formazione di ATP nell'unità F1 . L'esistenza di un gradiente protonico può spiegare il meccanismo d'azione dei disaccoppianti: il dinitrofenolo è un acido, la sua base coniugata, l'anione dinitrofenolato, è il reale disaccoppiante, perché può reagire con i protoni dello spazio intermembrana, riducendo la differenze di concentrazioni ai due lati della membrana. Gli antibiotici disaccoppianti sono ionofori, creano un canale attraverso cui ioni come H+, K+ e Na+ possono attraversare la membrana mitocondriale interna dissipando il gradiente protonico e disaccoppiando fosforilazione dall'ossidazione. Che cos'è l'accoppiamento conformazionale? In questo sistema il gradiente di protoni determina variazioni conformazionali di un certo numero di proteine , in particolare della stessa ATP sintasi. Esistono tre siti sulla sintasi per il substrato, e tre stati conformazionali possibili: aperto (O), con una bassa affinità per il substrato (L, cataliticamente inattivo), con un'alta affinità per il substrato (T, cataliticamente attivo). Ad un dato tempo, ogni sito è in uno dei tre diversi stati conformazionali e questi stati si interconvertono in conseguenza del flusso dei protoni attraverso la sintasi. L'ATP già formato dalla sintasi è legato al sito nella conformazione T, mentre l'ADP e il Pi si legano al sito nella conformazione L. un flusso di protoni converte il sito dalla conformazione T alla conformazione O, rilasciando ATP. Il sito nel quale sono legati ADP e Pi assume la conformazione T, che dà luogo alla formazione di ATP. È stato recentemente dimostrato che la porzione F1 dell'ATP sintasi agisce come un motore rotatorio. In breve l'energia chimica del gradiente protonico è convertita in energia meccanica sotto forma di proteine rotanti, l'energia meccanica è poi convertita in energia chimica immagazzinata nei legami fosforici ad alta energia dell'ATP. Gli inibitori della respirazione possono essere utilizzati per lo studio del trasporto degli elettroni: quando il flusso di elettroni si blocca in una serie di reazioni redox, i composti ridotti si accumulano a monte del punto di arresto nella via. I composti che si trovano oltre al punto di arresto saranno carenti di elettroni e tenderanno a trovarsi nella forma ossidata. Utilizzando inibitori della respirazione, possiamo raccogliere ulteriori dimostrazioni per stabilire l'ordine dei componenti nella via del trasporto degli elettroni.

I sistemi navetta: il NADH è prodotto dalla glicolisi, che avviene nel citosol, ma il NADH del citosol non può attraversare la membrana mitocondriale interna per entrare nella catena di trasporto degli elettroni. Gli elettroni possono essere trasferiti ad un trasportatore che può attraversare la membrana. Il numero di molecole di ATP generate dipende dalla natura del trasportatore, che varia in base al tipo di cellula considerato. In che modo i sistemi navetta differiscono fra loro? Un sistema di trasporto molto studiato nel muscolo per il volo degli insetti è il sistema navetta (shuttle) del glicerolofosfato (presente anche nei muscoli/cervello dei mammiferi). Questo meccanismo utilizza la presenza, sul lato esterno della membrana mitocondriale interna, di un enzima FAD-dipendente che ossida il glicerolo-fosfato. Abbiamo nel citosol il diidrossiacetone fosfato che è ridotto a glicerolo-fosfato dall'enzima glicerolo fosfato deidrogenasi citosolica, con conversione di NADH a NAD+; il glicerolo fosfato può entrare nel mitocondrio e viene riossidato dall'enzima FAD-dipendente (glicerolo fosfato deidrogenasi mitocondriale), con conversione di FAD a FADH2 → FAD in questa reazione si comporta da agente ossidante, fa passare gli elettroni attraverso la catena di trasporto degli elettroni portando alla produzione di 1,5 moli di ATP per ogni mole di NADH del citosol. Un meccanismo navetta molto più complesso ed efficiente è la navetta del malato-aspartato, scoperto nei reni/fegato e cuore dei mammiferi. Questa navetta sfrutta il fatto che il malato, e non OAA, può attraversare la membrana mitocondriale. In questo meccanismo, il trasferimento di elettroni dal NADH nel citosol produce NADH nel mitocondrio. Nel citosol , OAA è ridotta a malato dalla malato deidrogenasi citosolica, con conseguente ossidazione del NADH citosolico a NAD+. Il malato attraversa la membrana mitocondriale e nel mitocondrio la riconversione del malato in OAA (ossidazione del malato) è catalizzata dalla deidrogenasi mitocondriale, con produzione di NADH; OAA può essere convertito in aspartato, che può attraversare anch'esso la membrana mitocondriale, e l'aspartato può essere convertito in OAA nel citosol, completando il ciclo delle reazioni. Il NADH prodotto nel mitocondrio passa perciò gli elettroni alla catena di trasporto. Con questo shuttle, 2,5 moli di ATP sono prodotte per ogni mole di NADH del citosol....