Chapitre 2 la croissance bactérienne PDF

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mr GIRAUDET université Jean Monnet saint Etienne...

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Hervé GIRAUDET

La croissance bactérienne Introduction La croissance, au sens large, est défini comme une augmentation coordonnée des constituants cellulaire ce traduisant par une augmentation de la taille. Chez les bactéries, la croissance ne correspond pas à une augmentation de la taille de la bactérie. Chez les procaryotes, la croissance correspond à l’augmentation du nombre d’individu dans la population. Autrement dit, le terme de croissance est très lié au terme de multiplication des individus, de division des cellules, pour faire augmenter la population. Contrairement aux eucaryotes, cette croissance ne se mesure pas à l’échelle d’un individu mais d’une population.

I - Courbe de croissance bactérienne Si l’on place des bactéries dans un milieu approprié, dans un milieu de culture, la population va croitre avec un taux caractéristique de l’espèce. Cette croissance bactérienne va être tôt ou tard limité soit par une limitation dans le temps soit par le manque de nutriment soit les bactéries finiront par s’épuiser et les déchets des bactéries finissent par altérer la multiplication. Batch culture : milieu non-renouvelé La croissance bactérienne va finir par s’interrompre, et on va tracer la courbe de croissance bactérienne en milieu non renouvelé comme : log (du nombre de bactérie vivante) = f(temps) Donne une courbe à toujours 4 phases : • phase 1 : phase de latence

CROISSANCE BACTERIENNE Log nombre cellules viables

• phase 2 : phase exponentielle • Phase 3 : phase stationnaire (plateau) • Phase 4 : phase de décroissance (de déclin, de mortalité) Leur durée peut varier en fonction des espèces.

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4 Temps (h)

Courbe de croissance bactérienne en milieu non reno uvelé 1: Phase de latence 2: Phase exponentielle (logarithmique ) 3: Phase stationnaire 4: Phase de décroissance (de déclin, de mortalité )

1. Phase de latence Cette courbe que si l’on met des bactéries dans un nouveau milieu, elles ne se multiplient pas de suite. Le nombre d’individu n’augmente pas tout de suite. La durée de cette phase va dépendre de plusieurs critères : !1

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• composition du milieu : si le milieu est très différent d’où elles viennent, la phase de latence sera plus longue, temps d’adaptation des bactéries à ce nouveau milieu. A l’inverse, si le nouveau milieu est similaire, la phase de latence sera plus courte. Cette phase correspond donc à la phase d’adaptation enzymatique aux nutriments. • l’âge des bactéries : plus elles sont âgées (plus de 24h), moins elles se multiplient vite, donc plus la phase de latence sera longue. • la densité de bacteries : plus le nombre de bactérie est élevé dans l’inoculum, plus la phase est court et inversement. On peut réduire/effacer cette phase de latence si l’on prend des bactéries jeunes que l’on repique dans le même milieu.

2. La phase exponentielle (ou logarithmique) On assiste à un dédoublement de la population pendant un laps de temps régulier ou temps de génération G. Exemple : Chez E coli toutes les 20 minutes la population se dédouble or dans l’intestin on est plus à l’échelle de 5h. Pendant cette phase, les bactéries se multiplient à une vitesse constante qui est leur vitesse maximale. La vitesse maximale dépend de l’espèce mais aussi de l’environnement. De nombreux paramètres interfèrent sur la pente de cette phase comme la température. Suivant ces variations, on aura des pentes plus ou moins accrue : • bactéries qui se multiplient dans des milieux chauds : bactéries thermophiles (55°C). la pente très élevée en phase exponentielle. • bactéries qui se multiplient dans des milieux froids : bactéries psychrophiles (10°C) la pente est moins forte que les thermophiles. • bactérie mésophiles (37°C) la pente est donc intermédiaire.

3. La phase stationnaire S’explique soit par un arrêt de la multiplication bactérienne, soit par un équilibre entre la multiplication et la mort bactérienne. Cette phase stationnaire dépend du milieu. Les facteurs limitant prennent le dessus sur la croissance. Dans les deux cas de figure, les bactéries voient leur multiplication diminuer ou leur mortalité augmenter ; soit par limitation de nutriment dans le milieu, soit épuisement d’un paramètre physico-chimique dans l’environnement (exemple : plus assez d’oxygène pour les bactérie aérobies), soit par l’accumulation de déchets toxiques déposés par les bactéries mortes.

4. La phase de décroissance Un moment donné la mortalité va prendre le dessus c’est la phase de décroissance. Les bactéries ne se multiplient plus, elles sont de plus en plus nombreuses à mourir, avec un taux de mortalité !2

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(la pente) sera caractéristique de l’espèce. Cette pente peut aussi être influencé par les paramètres environnementaux énumérés lors de la phase. La vitesse est là aussi croissante. Remarque : De temps en temps, présence d’une 5ème phase facultative, avec une croissance cryptique, une reprise de multiplication. Des bactéries dites saprophytes, ce sont des microorganismes qui vivent sur les déchets, les cadavres des bactéries en décomposition. Phase 5 optionnelle. AS : SEULEMENT 4 PHASES OBLIGATOIRES Log nombre cellules viables

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Croissance cryptique 4 Temps (h)

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Courbe de croissance bactérienne en milieu non reno uvelé

II - Influence de l’environnement sur la croissance bactérienne La croissance des bactéries est très influencées par la nature chimique et physique de leur environnement, toute croissance nécessite une provision de nutriments, une source d’énergie, de l’eau, la température appropriée, le pH adapté, et une concentration en oxygène optimale.

1. Température et croissance bactérienne Il faut savoir que les bactéries sont des organismes poïkilothermes, c’est à dire que leur température varie avec celle de l’environnement. Or les enzymes sont sensibles à la température et possèdent toutes 4 températures cardinales: • température maximale (Tmax): au dessus de laquelle la croissance est stoppée •température minimale (Tmin): en dessous de laquelle la croissance bactérienne n’a pas lieu. • température optimale: température à laquelle la bactérie va croitre à sa vitesse maximale. La température optimale est toujours plus proche de la température maximale que la température minimale. Suivant la gamme de température comprise entre la température minimale et la température maximale : • les bactéries eurytherme : pour lesquelles la température minimale est très éloignées de la température maximale : grande gamme de température entre le minimum et le maximum (exemple : E coli ou Enterococcus) • les bactéries stenotherme : la température minimale est plutôt proche de la température maximale: pour lesquelles la gamme de température est moins élevée (exemple : Neisseria)

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On classe aussi les bactéries en fonction de leur température optimale de croissance, ce qui donne 4 grands groupes de bactéries : • les bactéries mésophyles : les plus nombreuses, celles du corps humain, 30-37°C, ce sont les bactéries des flores commensales (bactériennes) de l’organisme (exemple : E. Coli). • les bactéries psychrophiles : p avec une température optimale autour de 10°C. Surtout des bactéries aquatiques (exemple : pseudomonas, basiles gram -) • les bactéries cryophiles : température 0-4°C, plutôt dans les glaciers de l’Artique, Antartique, (Exemple : Aeromonas, des baciles) •les bactéries thermophiles : température optimale de 55°C, que l’on retrouve beaucoup dans les sources d’eau chaude, robinets d’eau chaude, dans les compostes (Exemple : Legionella). Au delà de 80°C, mise à part quelques mutants rares, les procaryotes sont éliminés.

CLASSIFICATION DES BACTERIES EN FONCTION DES TEMPERATURES DE CROISSANCE

CATEGORIES

TEMPERATURES OPTIMALES

EXEMPLES

MESOPHILE

30-37 °C

Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis

PSYCHROPHILE

~ 10°C

Pseudomonas, Flavobacterium

CRYOPHILE

0-4°C

Pseudomonas, Aeromonas

! THERMOPHILE

~ 55°C

Bacillus, Clostridium, Legionella

2. La

teneur en oxygène

et croissance bactérienne Bactéries aérobies qui ont besoin d’oxygène, alors que les bactéries anaérobies se multiplient en l’absence d’oxygène, elles fermentent et vivent dans des milieux sans oxygène. • Les bactéries aérobie-stricte tire leur énergie uniquement de la respiration. • Les bactéries micro-aérophile sont des bactéries aérobie qui se développe quand la concentration en oxygène est faible.

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• Les bactéries aero-anaerobies (anaérobie facultative) sont capables de se développer avec ou sans oxygène: respire ou fermente selon l’environnement. • Les bactéries aérobie stricte qui ne tolèrent pas l’oxygène et qui ne tire leur énergie que de la fermentation. Pour observer le type de bactéries que l’on a on peut les incuber pendant plusieurs heures et on observe leur répartition voir illustration.

AEROBIES STRICTES

ANAEROBIES STRICTES

AERO-ANAEROBIES

!Ex: Neisseria

Ex: Clostridium

Ex: Staphylococcus

MICRO AEROPHILES Ex: Campylobacter

Remarque : Parfois des bactéries anaérobie stricte arrivent à se multiplier en présence d’oxygène quand elles sont associées à des bactéries aero-anaerobie qui consomme de l’oxygène.

3. Le pH et la croissance bactérienne Les pH interfèrent sur la croissance des bactéries. Toute les bactéries ont des pH cardinaux avec un pH maximal, un pH minimal, et un pH optimal.

CLASSIFICATION DES BACTERIES EN FONCTION DES PH DE CROISSANCE CATEGORIE

PH OPTIMAL

EXEMPLES

ACIDOPHILE

1 – 5,5

Thiobacillus

5,5 - 8

Staphylococcus Escherichia coli Pseudomona s

NEUTROPHILE

8,5 – 11,5 ALCALOPHILE

Microcystis Bacillus

On classe les bactéries uniquement en fonction de leur pH optimal de croissance : • les bactéries qui aiment les pH acide, entre 1 et 5,5 : bactéries acidophiles. On les retrouve dans les sols acides, les sourdes d’eau chaude acide... (exemple : le thiobacillus) !5

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• les plus répandues sont les neutrophiles, pH entre 5,5 à 8 (exemple E. Coli) • les bactéries qui aiment les pH basique, les milieux alcalin, qui se multiplient que si le pH est au moins à 8,5. On parle de bactéries alcalophiles, que l’on retrouve dans les eaux douces, les fleuves(cyanobacteries)... !

4. Autres paramètres influençant la croissance bactérienne *La pression atmosphérique, avec des bactéries qui peuvent supporter des pressions beaucoup plus élevées, comme au fond de l’océan, en forte profondeur. • Celles qui aiment les pressions élevées sont dites barotolérantes on les retroves au fond des grands océans. Parmi ces bactéries barotolérantes pour qui cette pression élevée est nécessaire pour se multiplier : on parle de bactérie barophyles. *La pression osmotique : la membrane plasmique est une barrière osmotique, et il existe des bactéries qui peuvent supporter des pressions osmotique sans subir de choc osmotique (exemple dans les milieux salés), on parle de bactéries halophiles (NaCl entre 0,2 et 5,2 M). Par opposition, les non-halophiles (NaCl < 0,2M) sont celles qui ne supportent pas ces chocs osmotique. Les bactéries hyperhalophyles (NaCl > 5,2M) nécessite cette pression très élevée pour se multiplier. Les radiations : à la surface de la planète on est bombardé en permanence. Ces radiations peuvent interférées sur la multiplication (exemple : lampe UV pour stériliser).

III - Méthodes de mesure de la croissance bactérienne Il existe plusieurs techniques de mesure, avec toutes des avantages et des inconvénients.

1. Mesure du nombre de cellules bactériennes On compte les bactéries en les regardants. Il faut donc utiliser la microscopie avec au moins un objectif 40. On a fabriqué des lames spéciales, des lames croisées de chambres de comptage (petites cuves), qui sont des chambres de contage. Elles permettent de renfermer plus de bactérie qu’une lame plate. • Exemple : Lame de Petroff Hausser AS: En vue latérale, au milieu de la lame, on a une chambre centrale, qui fait 0,02 mm d’épaisseur. Cette rigole est subdivisée en deux parties, et sur ces deux parties, on a mit en place un quadrillage au fond de la cuve, au fond de la chambre. Sur une lame de Petroff Hausser, le carré central fait 1 mm de côté. 1ère étape : avoir une suspension homogène et on remplit la cuve de contage (du milieu). Les bactéries vont sédimenter. On peut alors compter les bactéries dans les 25 carrées du milieux. Pour connaitre le nombre de bactérie par mm2 :

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compter les bactéries dans les 25 carrés : 50 cellule/mm2

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on divise par l’épaisseur pour obtenir des mm3 : 50/0,02

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on trouve le nombre de cellule : 2500 cellules/mm3

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pour obtenir le résultat en L : 2500 * 106 bactéries/L = 2,5.109 bactéries/L. Il faut

toujours exprimer le résultat avec un chiffre après la virgule pour avoir l’ordre de grandeur. Les bactéries que l’on compte sont soit vivante soit morte, il faut toujours la même personne qui compter les bactéries pour qu’il n’y ai pas de biais de comptage. Machine qui le fait : compteurs Coulter. Cette machine cependant a tendance à sousestimer le nombre de bactérie à cause des associations. Remarque : Autre exemple de lame, la lame de Thomas, lame en verre, qui a une cuve au milieu, avec une épaisseur de 0,1 mm et que le petit carré central contient 400 carrés sur 1 mm2.

• Autre méthode où l’on ne compte que ce qui est vivant. Il faut donc ne pas s’intéresser aux cellules mais aux colonies. On compte les colonies qui poussent et ce multiplient sur le milieu de culture. C’est la méthode des dilutions. On part d’un échantillon que l’on va dilué de 10 en 10. On va avoir ainsi des suspensions pure jusqu’à 10-9. Ces échantillons vont être ensemencé en nappe pour chaque dilution. On fait incuber 24h à 37°C. Le but est d’obtenir des colonies isolées comptables sur une boite. Pour ce, on ne s'intéresse qu’aux boites qui après incubation renfermeront entre 30 et 300 colonies. Les cellules de la colonie viennent toutes de la même cellule mère. Pour que cette méthode est une valeur statistique, on fait cette manipulation en 3 exemplaires. Le laborantin compte ¼ de la boite et multiplie par 4 pour avoir le nombre total. Il faut penser par multiplier par l’inverse de la dilution ce que l’on a compté. On exprime avec un chiffre après la virgule : Pour la deuxième boite (10-1) du poly p26 - 96 x10 - 960 col/mL - 960.103 col/L - 9,6.105 col/L - 9,6.10-5 UFC/L (UFC = Unité Formant Colonie).

2. Mesure la biomasse Ces techniques appliquées sont basées sur le fait que les bactéries dispersent la lumière. Avec une souche pure, dans une population bactérienne, les bactéries ont approximativement toute la même taille. On peut donc dire que dans cette souche pure la quantité de lumière dispersée sera proportionnelle à la concentration bactérienne. Cette méthode s’applique dans des milieux !7

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liquides, des bouillons. On mesure la turbidité du milieu. La biomasse bactérienne peut donc être estimée par turbidimétrie. Une méthode optique qui s'intéresse à l’absorbance des bactéries à une longueur d’onde précise. La longueur d’onde la mieux adapté est une longueur d’onde de 420 nm. On utilise un spectrophotomètre réglé sur 420 nm, c’est à cette longueur d’onde que l’absorbance est caractéristique de la concentration, elle est directement linéaire et en lien avec la concentration bactérienne. Les inconvénients sont : • nécessite quand même une concentration bactérienne assez élevée pour pouvoir être détectée : moins de 1 000 000 ne marchera pas. • nécessite de travailler avec des bouillons incolores, transparents • on ne distingue pas ce qui est vivant de ce qui est mort Plus il y a une absorbance élevée, plus il y a une concentration bactérienne importante.

Autrefois, on avait pour méthode de peser les bactéries : on les déshydratait pendant plusieurs jours, et on mesurait le poids sec en bactéries. Il fallait plusieurs milliards pour pouvoir mesurer quelque chose. L’absorbance a une longueur d’onde de 420 nm témoigne de la concentration bactérienne

Concentration bactérienne élevée Lumière diffractée +++

!

Absorbance élevée

3. Mesure des constituants cellulaires On va se servir d’autre éléments comme la quantité de nutriment consommé, les déchets rejetés, les concentrations en métabolites... On a alors cherché des constituants bactériens que l’on ne trouve pas dans le milieu environnant qui sont en quantité constante dans les bactéries et qui disparaissent à la mort de celle-ci. Ces constituants auront alors une concentration qui reflétera la concentration bactérienne.

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Il y a plusieurs méthodes, plusieurs constituants : mesure de l’ATP dans nos échantillons par bioluminescence par un picoATPmètre. C’est un bon indicateur de la concentration bactérienne. On peut aussi s’intéresser à la quantité d’azote totale dans les bactéries ; la quantité de phosphatases alcalines ; la perte en nutriment du milieu ; la quantité de déchet libéré dans le milieu.

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