Cromatografía - parte teorica de la cromatografia PDF

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Universidad NacionalAutónoma deMéxicoFacultad de Estudios SuperioresZaragozaResumen: Compuestos que dan color a los vegetales Los pigmentos vegetales, pueden dividirse en dos grandes grupos, en base a su solubilidad: a) Solubles en agua: antocianinas y antoxantinas, que se encuentran en el jugo vacu...

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Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Zaragoza

Resumen: Compuestos que dan color a los vegetales Los pigmentos vegetales, pueden dividirse en dos grandes grupos, en base a su solubilidad: a) Solubles en agua: antocianinas y antoxantinas, que se encuentran en el jugo vacuolar. b) Solubles en solventes orgánicos: clorofilas "a" y "b" y carotenoides (rojo, naranja y amarillo), que se encuentran en las granas y tilacoides de los cloroplastos. Son los responsables de la captación de la energía luminosa en el proceso de la fotosíntesis. Las clorofilas poseen unas estructuras porfirínica, formada por cuatro anillos pirrólicos con un átomo de magnesio en su centro, un anillo de ciclopentanona y un éster de fitol unido a uno de los anillos de pirrol que provee a la molécula de una cola lipófila. La diferencia entre las distintas clorofilas existentes (se conocen al menos siete) se encuentran en los sustituyentes que se presentan; así la clorofila "a" (verde azulada) presenta un grupo metilo (-CH3) en el carbono 3, y la "b" (verde amarillento) un grupo aldehído (-CHO) en la misma posición. Existen plantas que contienen solamente clorofila "a", como las algas azules, las diatomeas, las algas rojas y las pardas. Sin embargo, muchas de ellas contienen en los plastidios, pigmentos adicionales tales como otras clorofilas (c, d, e), fucoxantinas (amarillo pardo) y ficocianina (azulado), que comunican sus respectivos colores a las algas. Entre los carotenoides se encuentran los carotenos (anaranjados), cadenas hidrocarbonadas de unos cuarenta átomos de carbonos, y las xantofilas (amarillas Cromatografía: espinaca. u ocre), que son derivados oxigenados de aquellos. Extracción de sus pigmentos por maceración, extracción continua y

Materia: Laboratorio de orgánica. discontinua.

Nombres: Oliva Hernández Carla Mailyn ● Maceración: La maceración es un proceso de extracción sólido-liquido . Rojas Gallegos Ana Cristina donde la materia prima posee una serie de compuestos solubles en el

Profesor: Guadalupe Cabrera Jiménez.

líquido de extracción que son los que se pretende extraer. El proceso de

Grupo: 2354

maceración genera dos productos que pueden ser empleados dependiendo de las necesidades de uso, el sólido ausente de esencias o el propio extracto. La naturaleza de los compuestos extraídos depende de la materia prima empleada, así como del líquido de extracción (Femaroli's, 1975). Existen dos métodos de maceración de acuerdo a la temperatura, caliente y frío. ● Maceración en frío: Consiste en sumergir el producto a macerar en un recipiente con la cantidad suficiente de solvente para cubrir totalmente lo que se desea macerar. Esto se lleva a cabo por un lapso de tiempo largo dependiendo de la materia prima que se vaya a macerar Fernaroli's. 1975. Las ventajas de la maceración en frío consisten en la utilización de equipos simples que requieren mínima cantidades de energía y en la capacidad de extraer la mayoría de las propiedades de lo que se macera (dependiendo del solvente), prácticamente en su totalidad sin alterarla por efectos de temperatura. Sin embargo, se necesitan periodos de tiempo mucho más extensos para lograr una extracción adecuada ● Maceración con calor: El proceso consiste en el contacto entre las fases, el producto a macerar y el solvente: con la diferencia de la variación en la temperatura, en este caso pueden variar las condiciones de la maceración. El tiempo que se desea macerar varía mucho de la maceración en frío ya que al utilizar calor se acelera el proceso (Femaroli’s 's, 1975). La desventaja de la maceración en calor es que no logra extraer totalmente pura la esencia del producto, ya que regularmente destruye algunas propiedades, es decir, muchas veces se trata de compuestos termolábiles que se ven afectados por la temperatura, además de que equipos más sofisticados que permitan el control de temperatura, sin mencionar el consumo energético que dicho рrосеѕо implica. No obstante, los periodos de tiempo de extracción se reducen favorablemente ● Extracción discontinua: En el caso favorable de una mezcla de sólidos en la cual uno de los compuestos es soluble en un determinado disolvente (normalmente un disolvente orgánico), mientras que los otros son

insolubles, podemos hacer una extracción consistente en añadir este disolvente a la mezcla contenida en un vaso de precipitados, un matraz o una cápsula de porcelana, en frío o en caliente, agitar o triturar con ayuda de una varilla de vidrio y separar por filtración la disolución que contiene el producto extraído y la fracción insoluble que contiene las impurezas. Cromatografía: ⮚ Cromatografía en capa delgada Este método es un utilizado para la separación, identificación y ensayo de muchas sustancias,

especialmente

materiales

bioquímicos,

productos

naturales,

preparaciones farmacéuticas y es una técnica muy adecuada para análisis clínicos. La cromatografía en capa delgada o bien cromatografía en capa fina proporciona separaciones más rápidas y completas y necesita cantidades de muestra en disolución muy pequeñas. Esta se divide en dos: ● La cromatografía analítica; se utiliza para separar mezclas, y tiene como principal objetivo determinar la identidad

y concentración de los

componentes de una mezcla. ● La cromatografía preparativa; se emplea para purificar grandes cantidades de una especie molecular. 6.1. Equipo utilizado: ● Placas: Es una lámina de vidrio, metal. Fase estacionaria. ● Absorbente ● Cubeta cromatográfica o cámara de elusión ● Eluyente: fase móvil ● Muestra ● Capilares ● Visor ultravioleta Se colocan las muestras a un centímetro del borde en uno de los extremos de la placa, se deja secar, se coloca la placa en una cubeta cromatográfica, la cual contiene una pequeña cantidad de solvente, se tapa y se deja correr por un rato. El solvente subirá por capilaridad e irá arrastrando las moléculas, las cuales se moverán según la afinidad que muestren por la fase estacionaria.

Dimensiones de las placas o soporte: Las placas se cortan en porciones pequeñas de aproximadamente 3x5 cm, o según sean los casos, 20x20 cm y 10x20. Limpieza del soporte: para el trabajo a pequeña escala, las placas deben limpiarse con una mezcla de cloroformo y metanol, después se dejan secar completamente antes de aplicar la muestra. Preparación

de

las

placas

de

Inmersión

y

revestimiento: Limpiar

perfectamente las placas por inmersión en mezcla sulfocrómica y luego lavarlas con abundante agua hasta que el líquido que escurre no deje en la superficie de las placas manchas visibles. Secarlas perfectamente. Suspender el adsorbente, con el agregado o no de reactivos, como por ej., soluciones reguladoras, sustancias fluorescentes, etc., en agua o en solventes orgánicos volátiles, agitar durante 30 segundos, hasta formar una suspensión homogénea. Extender la suspensión sobre una o varias placas, manualmente o con ayuda del aplicador, hasta lograr una capa uniforme de 0,25 a 1 mm de espesor. Dejar en reposo durante 5 minutos. Secar a 105 °C durante 30 minutos y dejar enfriar en un desecador. Generalmente 30 g de adsorbente y 60 ml de agua son suficientes para cinco placas de 20x20 cm. Cuando las placas estén secas y a temperatura ambiente, verificar la uniformidad de la distribución y la textura de la capa adsorbente; la luz transmitida muestra uniformidad en la distribución y la luz reflejada muestra uniformidad en la textura. Conservar las placas cromatográficas en un desecador. Deben emplearse dentro de los tres días posteriores a su preparación. Activación y almacenamiento de las placas ⮚ Activación: Antes de que se puedan usar las placas generalmente deben ser calentadas para retirar el agua que actúa como una impureza la cual evita una buena separación. Se deja secar la pasta que se aplique (absorbente) durante 30 minutos o más para que quede adherida, la capa formada se activa por calentamiento, normalmente en posición vertical a 100-110°C durante diversos periodos de tiempo (una a varias horas).

⮚ Almacenamiento: las placas se conservan en un desecador hasta el momento en que vayan a ser utilizadas Aglutinante o adhesivo empleado en absorbentes: ● Aglutinante, es una sustancia química que permite que una sustancia en la cual sus partículas son en polvo o secas, en este caso el adsorbente, permanezcan juntas. Como es el almidón, yeso, harina de maíz, sulfato de calcio hidratado, etc. Los absorbentes más utilizados son los siguientes: ● Gel de sílice (se utiliza en el 80% de las separaciones) ● Óxido de aluminio o Alúmina (ácida, neutra o básica) ● Celulosa (nativa o micro-cristalina) ● Poliamidas Para la selección de absorbente se debe

tomar en cuenta las siguientes

condiciones: ● Polaridad ● Tamaño de partícula ● Diámetro ● Área superficial ● Homogeneidad ● Pureza Cámara de elución: Una cámara de elución en un recipiente, preferentemente de vidrio transparente para observar la separación de componentes en la cromatografía en capa fina. Cantidad de absorbente a utilizar: Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño de las partículas del adsorbente, cuanto más finamente dividido esté mayor será su adhesión al soporte, aunque también se le puede añadir un adherente. Si está llevando a cabo una separación cromatográfica en una muestra de 1.0 g, 15 g de gel de sílice serían apropiados. El gel de sílice tiene una densidad aparente de aproximadamente 0,3 g / cm, por lo que 15 g ocuparían un volumen de 45-50 cm (45-50 ml); Esta cantidad se llama volumen de columna. Con el

objetivo de una altura de columna de 15 cm de gel de sílice, puede calcular el diámetro interior de la columna de cromatografía necesaria. La columna de gel de sílice es un cilindro con un volumen de nrk si - 15 cm y V = 50 cm ', entonces r 1.0 cm. Por lo tanto, una columna de cromatografía con un diámetro interno de 2-2.5 cm sería apropiada. Los diámetros interiores comunes para las columnas de vidrio disponibles comercialmente que se usan en la cromatografía instantánea son 1.0, 1.5, 1.9 y 2.5 cm. Aproximadamente dos volúmenes de columna de solvente de elución sobre el adsorbente se usan generalmente para empujar el líquido a través de la columna de gel de sílice en LC por gravedad. Por lo tanto, la separación cromatográfica de 10 g de material sobre gel de sílice requeriría una columna de vidrio de 2 cm de diámetro y 40 cm de largo. Ya sea una columna de cromatografía comercial de 2,5 cm de diámetro y 30 cm de longitud o una de 1,9 cm de diámetro y 40 cm de longitud sería apropiada para la separación de una muestra de 1,0 g. Precauciones al prepararlas y efectuarlas y parámetros que afectan la preparación: ● Precauciones al prepararla ● Preparación de las placas ● Conservar la placa en una solución concentrada de carbonato sódico, enjuagándose en agua antes de su uso ● Si el material se adhiere mal es necesario agregar una pequeña cantidad de un agente aglomerante como el sulfato cálcico. ● Activar las placas antes de usarlas. ● Parámetros que afectan la preparación: ● La polaridad es el factor que más influye en este tipo de cromatografía, si la placa está formada por una capa de gel de sílice, una sustancia muy polar, y, por lo tanto, atraerá en mayor medida a componentes muy polares. Por lo tanto, las sustancias más polares reaccionarán más con el soporte y su velocidad de desplazamiento será menor.

● Temperatura: a menor temperatura las sustancias se absorben más en la fase estacionaria. ● La cromatografía debe llevarse a cabo en un área sin corrientes de aire ● Verificar que la limpieza de las placas se realice correctamente para evitar que estén contaminadas con grasa, agentes plastificantes o adhesivos, es recomendable utilizar guantes. ● Pureza de los disolventes Definición de términos Rf y Rx: La identificación de cada una de las manchas se realiza de acuerdo con su color y denominado valor Rf (Factor de retención), es decir, es el registro en una relación de distancias. El Rx es la razón de la distancia recorrida entre la sustancia problema y el compuesto de referencia

Aplicaciones de la cromatografía: puede utilizarse principalmente para: ● Identificación de alguna sustancia conocida en una mezcla por su comparación con un patrón de la sustancia pura. ● Medir el grado de pureza de una muestra, si existen varias manchas en el cronograma, es señal de que existen varios componentes en la mezcla.

● Obtener una medida semicualitativa de algún componente. Cuanto mayor sea la mancha en el cromatograma, la concentración de esa sustancia Será mayor. 6.13. Como se lleva a cabo la cromatografía en placa preparativa: Cromatografía de capa fina a escala preparativa. La cromatografía de capa fina a escala preparativa se puede realizar en placas disponibles comercialmente o en placas preparadas por uno mismo. La cromatografía preparativa de capa fina se lleva a cabo generalmente en placas de 5 cm x 20 cm o 20 cm x 20 cm. Se prepara una suspensión del adsorbente en un disolvente volátil y se vierte sobre la superficie de la placa. La suspensión se extiende uniformemente sobre la placa mediante el uso de una espátula ancha o haciendo rodar suavemente la placa. El plato se seca en un horno. La muestra se aplica a la placa mediante el uso de una pipeta capilar, o una pipeta desechable, en una banda desde el fondo de la placa. Se debe tener cuidado para no raspar y dañar la superficie de la placa. La placa se desarrolla como se describió anteriormente, y las bandas que indican la presencia de compuestos se cortan y raspan cuidadosamente de la placa. El material eliminado se extrae luego con un disolvente apropiado para recuperar el compuesto orgánico. Ventajas y desventajas: ● Ventajas: ● Análisis químico de materias orgánicas complejas ● Separación e identificación de compuestos o mezclas ● Identificación en cantidades de orden en microgramos ● No se requieren cantidades grandes de muestra ● Resultados son fácilmente reproducibles ● En la preparación de las placas también se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes ● El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho mejor.

menor

y

la

separación

es

generalmente

● Desventajas: ● Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adición disoluciones tamponadoras para mantener el pH deseado.

⮚ Cromatografía de sustancias incoloras Si la mezcla es incolora, se somete la placa a algún tratamiento con una sustancia desarrolladora para poder determinar la presencia de sustancias o de ser necesario se utiliza un visor ultravioleta.

⮚ Cromatografía de columna Equipo utilizado: El primer paso en el montaje de la columna cromatográfica es colocarla fija en posición vertical. A continuación, se pone en el fondo de la columna un pequeño disco de porcelana con varios orificios (si es posible) y encima de este un poco de lana de vidrio. Este dispositivo retiene el material sólido de la columna mientras que el líquido eluyente puede circular libremente. El adsorbente puede introducirse en seco, pero lo más frecuente es agregarlo en forma de una papilla con el eluyente. Antes de introducir el adsorbente se agrega en el interior de la columna un poco de disolvente puro (2 a 4 cm. por encima de la lana de vidrio) y se elimina el aire que puede permanecer retenido en las paredes, agitando por medio de una varilla larga de vidrio. La papilla formada por el adsorbente y el disolvente se agrega lentamente en porciones, lo que permite que se pose el adsorbente por la fuerza de la gravedad, hasta alcanzar la altura deseada. Es recomendado el golpear la columna durante el llenado con un tubo de goma para favorecer la formación del lecho adsorbente. Finalmente se abre la llave inferior de la columna para que salga el exceso de disolvente contenido. La altura del disolvente no debe exceder de 2 a 5 mm sobre el sólido. Una vez realizado todo esto, la columna esta lista para introducir la muestra que se desea separar.

Relación diámetro/longitud de columna: Esta característica depende de cuánto material se quiera separar, además de que adsorbente se utilizará y la cantidad del mismo, usualmente, en una separación “común” se utilizaran de 10 a 20 veces más de sílice gel por peso del material por separar. Un diámetro de 1 a 2.5 cm es común para la cromatografía líquida con sálico gel.

Relación de cantidad de muestra y adsorbente: Para la cromatografía se utilizan cantidades relativamente grandes de adsorbente el cual permite un flujo rápido de la fase móvil. Estas cantidades pueden estar entre los 38 y 63 µm de sílice gel. Precauciones en la preparación y realización: ● No permitir que la columna se seque, cerrar la llave ● La temperatura del entorno debe ser constante

● Cuando se utilizan eluyentes con punto de ebullición bajo y cuando se cambian los disolventes se suelen formar burbujas en las columnas (acanalamiento) evitando una buena separación, se deben usar columnas en frío. ● El tamaño de las partículas del adsorbente debe ser el adecuado para una rápida y uniforme precolación y las partículas no deben ser porosas al disolvente. Velocidad de flujo: Durante el proceso cromatográfico los componentes de la muestra son arrastrados por la fase móvil a distintas velocidades efectuándose la separación. La velocidad de arrastre de cada componente depende de su grado de adsorción en la fase estacionaria y de su afinidad por la fase móvil. La velocidad de flujo depende de muchos factores cuando menos sea el tamaño de las partículas del adsorbente menor será la velocidad con la que el disolvente o la solución pasarán a través de la columna. Por lo tanto, el adsorbente no debe ser ni de grano muy grueso ni muy fino, el diámetro medio de las partículas debe ser de unas 8-12 micras. La aplicación de una succión suave o de cierta presión puede también acelerar la velocidad del solvente a través de la columna. La velocidad de separación de los componentes de una mezcla en una columna depende de la velocidad de flujo del solvente. Si esta varía, se puede echar a perder la separación. Por lo tanto, el flujo del solvente se mantiene constante conservando el solvente a nivel constante arriba de la superficie de la columna. Tipo de elución: proceso en el cual los solutos son lavados a través de una fase estacionaria por el movimiento de la fase móvil. ● Simple: La composición del eluyente no varía, no tiene que ser el solvente original usado para empacar la columna, pero no debe de ser muy diferente para provocar el enjutamiento de las cuentas de resinas de intercambio iónico. ● Fraccionada por gradiente: Se usa una mezcla de solventes o el solvente se cambia por completo. (Polaridad diferente). ● Análisis frontal: Únicamente se realiza en la cromatografía por adsorción. Aquí nunca ocurre una separación completa, en lugar de usar un solvente

como eluyente, la propia mezcla se agrega continuamente en la columna hasta que esta se satura, la técnica es útil para determinar el número de componentes que hay en una mezcla y la presencia de huellas de impureza en sustancias por otra parte puras. Recolección de fracciones en cromatografía en columna y placa preparativa: ● Recolección de fracciones: Eluir y secar de la columna el cuerpo del adsorbente, ya que el disolvente se ha evaporado de la columna se corta esta en rodajas, se extrae con disolvente cada rodaja y se analiza el compuesto (extracto). Antes de cortar la columna, si los compuestos no son coloreados se aprieta contra ellos una tira de papel para que adsorba un poco de disolvente. El papel una vez seco se pulveriza con un revelador que indica la posición de cada uno de los compuestos, el papel se coloca de nuevo al lado de la columna y así sabemos que componente contiene cada sección de la columna. Para un número grande de fracciones se usa un colector automático de fracciones (disco en el que se coloca una serie de tubos, el disco gira). En e...