Degradación de Edman PDF

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Degradación de EDMAN.Este método para determinar la secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína, puede ser utilizado para analizar un péptido sintético incluso si este aún se encuentra adherido a la resina. Sin embargo, no produce datos útiles en la región C-terminal. Consiste en la degradació...

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Degradación de EDMAN. Este método para determinar la secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína, puede ser utilizado para analizar un péptido sintético incluso si este aún se encuentra adherido a la resina. Sin embargo, no produce datos útiles en la región C-terminal. Consiste en la degradación repetitiva de los péptidos a partir de una reacción con el grupo amino terminal libre y con fenil isotiocianato (PITC) en condiciones alcalinas suaves formando feniltiocarbamilo, el producto es entonces tratado con ácido fluorhídrico para liberar el aminoácido que ha reaccionado del resto de la cadena peptídica mediante la formación de un derivado de tiazolinona, el cual es convertido a un derivado más estable (un aminoácido PHT) por la adición de TFA. Como consecuencia el péptido tiene ahora un nuevo residuo amino terminal listo para repetir el ciclo. La identificación de los PHT-aminoácidos es usualmente llevada a cabo por RP-HPLC. Los péptidos que ya han sido liberados de la columna y que son analizados por esta metodología no presentan ninguna consideración especial, no así cuando el péptido analizado aún se encuentra adherido a la columna. Debido a que este método requiere del grupo amino libre, los grupos protectores utilizados en la síntesis para proteger al αamino deben ser removidos o de otra forma no será posible analizar el péptido sintetizado mediante la degradación de Edman. Con respecto a los grupos protectores de las cadenas laterales, éstas sólo tendrán un efecto durante la identificación del aminoácido, ya que los grupos protectores tienden a hacer las cadenas laterales más hidrofóbicas; por la tanto el gradiente utilizado para eludir los PTH-aminoácidos en RPHPLC deben extenderse, aunque esto no sucede si tales grupos protectores son derivados de Boc, pues los aminoácidos serán desprotegidos por el uso de TFA durante la fase final. Los residuos de cisteína no pueden ser detectados por este método a menos que sean modificados, usualmente se utiliza acrilamida o bromopropilamina para derivatizarlos. Cuando el análisis es hecho en la resina, estos residuos pueden ser muy problemáticos, pues muchos de los grupos protectores utilizados para cisteína durante la síntesis no son estables a la química de Edman. La glutamina se cicla en condiciones ácidas para formar una estructura de piro glutamato, lo que hace que el péptido sea bloqueado y el análisis de la secuencia no pueda llevarse a cabo.

Pasos para seguir para secuenciar una proteína pura por el método de EDMAN.

1) Desnaturalizar, con urea, por ejemplo, y reducir los puentes disulfuro. 2) Bloquear los grupos –SH, con iodoacetamida por ejemplo. 3) Fragmentar la proteína en péptidos más pequeños, usando dos métodos diferentes (por ejemplo, digestiones con tripsina y BrCN) 4) Separar los péptidos obtenidos por el primer método por HPLC en fase reversa (RPHPLC). 5) Tratar cada péptido purificado con el reactivo de Edman, isotiocianato de fenilo, en un secuenciador automático. 6) Identificar los residuos de aminoácidos por RP-HPLC de los derivados de feniltiohidantoína (PTH-aminoácido) online en el secuenciador. 7) Hacer lo mismo con los péptidos obtenidos por el segundo método de ruptura de la proteína. 8) Armar la secuencia por superposición de los péptidos obtenidos por ambos métodos. “La mayoría de los métodos alternativos a la degradación de Edman surgen con la utilización de la espectrometría de masas (MS) como técnica analítica más efectiva para el estudio de la estructura primaria de las proteínas. Ellos se basan en la combinación de digestiones enzimáticas y/o en la modificación química de los grupos aminos primarios, con algún paso cromatográfico previo”

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