Einführung in die Molekularbiologie 1. Vorlesung DNA-Entdeckung, Replikation und Transkription PDF

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DNA-Entdeckung, Replikation und Transkription, Aufgaben des Nucleolus, Aufbau,
Hershey und Chase Experiment, Transkriptionsfaktoren, Operon, Sigma-Faktor, Avery, Macleod and McCarty, Kernmembran,...

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Einführung in die Molekularbiologie Für Molekularbiologen

1. Vorlesung DNA-Entdeckung, Replikation und Transkription Aufgaben des Nucleolus, Aufbau - “Schaltzentrale” - Kontrolle der gesamten Zellaktivität - Lager des größten Teils der genetischen Information der regulatorischen Maschinerie - Größe: ca. 6 µm Funktion: - „Lager“ der DNA - Ort für die DNA-Replikation/ Transkription - Ribosomen-Bildung: • Nukleolus (Kernkörperchen): „Ribosomenfabrik“ lokalsiert in Nachbarschaft einer sog. nucleolusorganisierenden Region (NOR) des Chromosoms, welches für die RNA und die Proteine der Ribosomen kodiert. - Kontrolliert durch die Regulation der Genexpression die Zellaktivitäten: • Wachstum • Zellteilung • Proteinexpression Aufbau: - Mit Doppelmembran umschlossenes Zellkompartiment - Besitzt Kernporen zur „Kommunikation“ mit der restlichen Zelle - Beinhaltet: • Nukleolus (Gebiet mit konz. Chromatin, RNA und Protein) • Chromatin • Nukleoplasma Kernmembran: - Als Barriere verhindert sie die unkontrollierte Diffusion von Makromolekülen vom Zellkern und dem Cytoplasma - Die äußere der beiden Membranen ist mit der Membran des rauen Endoplasmatischen Reticulums (RER) verbunden und die Ribosome haften an ihr - Die innere Membran ist mit einem dünnen filamentösen Netzwerk (Kernlamina) verbunden

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Transkription + Nutzen, Bestandteile Transkription: - Umschreiben von DNA (Template) in sogenannte RNA (Transkript) - mRNA wird benötigt für die Proteinsynthese - RNA-Polymerase verantwortlich, Syntheserichtung 5´- 3´ - Matrizenstrang (DNA-Strang) ist immer 3´- 5´ Strang

Welches Makromolekül ist Träger der genetischen Information -DNA (deoxyribonucleic acid) oder deutsch DNS (Desoxyribonukleinsäure)

Wie konnte man beweisen werden, dass die DNA Träger der genetischen Information ist? Durch 2 Experimente 1. Mit Pathogene Streptococcus pneumonie und Maus von Avery, Macleod and McCarty Ziel: Welches Makromolekül in der Zelle überträgt die genetische Information Es gibt zwei versch. Stämme

Wie war das Experiment augebaut? S ->bildet "Smooth" Kolonien. Polysaccharidkapsel schützt Bakterium vor dem Immunsystem der Maus->Zucker wirkt auf das Immunsystem wird normaler Zucker im Körper ->greift nicht an R-> bildet Rough Kolonien Keine Polysaccharidkapsel Experimentelle Ansätze Kontrolle 1: Bakterien des Typs ROUGH in Mäuse spritzen ->Maus wird nicht infiziert, weil Bakterien durch das Immunsystem abgetötet werden ->kein Schutz durch Polysaccharidkapsel Kontrolle 2: Bakterien des Typs ROUGH plus einen Extrakt von SMOOTH wird vorinkubiert und dann in Mäuse gespritzt ->Nachweis ob Bakterien in der Maus wachsen ->Sie wachsen in Mäusen Die Analyse: Wie Ansatz 2., aber den SMOOTH Extrakt so behandeln, dass Lipide oder Zucker oder Protein oder DNA zerstört wird und Kontrolle das nichts zerstört wurde -Es wurden 6 Mäuse verwendet 2

Ergebnis: Kontrollmaus mit normalen S-Stamm, Polysaccharid, Lipids, RNA, Protein (wurden zerstört) ->Maus starb und „s“ Bakterium hat regeneriert DNA Zerstörung nach DNAse Behandlung ->Maus lebt „s“ Bakterium hat sich nicht regeneriert (Zerstörung der Bakterien DNA) =>Beweis DNA ist für die genetische Information verantwortlich und steuert Zellprozesse

2. Hershey und Chase Experiment mit Bakteriophagen und E.coli Ziel: Weiterer Beweis, dass DNA das genetische Material ist

Wie war das Hershey und Chase Experiment aufgebaut? Versuchsobjekt: Bacteriophagen T2 Ein einfaches biologisches System, weil es nur aus 2 Makromolekülen besteht: DNA und Protein ->Bakteriophage nimmt Einfluss auf die DNA des Bakteriums, um weitere Bakteriophagen zu produzieren Radioisotope helfen die DNA und die Proteine zu unterscheiden: ->32P markiert hauptsächlich DNA ->35S markiert spezifisch Protein Experiment: Radioaktiv markierte Phagen wurden verwendet um nichtradioaktive Escherichia coli Zellen zu infizieren Nach erfolgter Infektion wurden die restlichen Phagenpartikel von den Zellen entfernt ->Phagenhüllen (ghosts) und E. coli Zellen werden getrennt und die Radioaktivität wird im Szintillationszähler gemessen Nur das genetische Material des Phagen wird in die Wirtszelle eingeschleust ->Spezifische Isotopenmarkierung wird zeigen, ob es sich um DNA oder Proteine handelt Ablauf: 3

1.Wachstum: Wachstum der E.coli in der Lösung (enthalten keine Radioaktivität) 2.-3. Bakterien + Phagen Inkubation mit Übertragung des genetischen Materials ->E.coli wird in zwei Bakteriophagen Lösungen gegeben ->Einmal zu Phagen mit radioaktiv markierter Schwefel (35S) und einmal Phagen mit radioaktiv markiertem Phosphor (32P) zugegeben ->Der radioaktive markierte Schwefel wurde dabei in die Proteine eingebaut. Der radioaktiv markierte Phosphor wurde dagegen in die DNA der gezüchteten Phagen eingebaut. 4-5. Trennung der Bakterien und den Überresten der Phagen durch zentrifugieren 6. Im Überstand befinden sich die Phagen(hüllen) und im Pellet die Bakterien 7. Messung, wo ist welche Radioaktivität zu finden ist Ergebnis: 35p im Überstand (Protein) 32p ist in den Bakterien (DNA) ->DNA ist genetisches Material ->weil in Bakterium gefunden ->Phage befällt Bakterien DNA um eigene DNA zu synthetisieren und dadurch neue Phagen zu produzieren

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Was ist die Replikation und wie funktioniert sie? Was sind Transkriptionsfaktoren? -Kurz TF -Sind regulatorische Proteine, die sich an spezifische Regionen der DNA binden -Dadurch kann die DNA-Polymerase nicht mehr binden -Die Transkription kann dadurch negativ oder positiv beeinflusst werden -TFs können die Transkription von Genen regulieren -TFs binden an Silencer oder Enhancer -Enhancer: -aktivieren die Transkription -Transkriptionsaktivatorproteine binden an den Enhancer (nicht transkribierte Gensequenzen) -beeinflussen die Anlagerung des Transkriptionskomplexes an den Promotor -Enhancer sind vor und hinter Promotoren -Es entstehen Schleifen -> räumliche Nähe der Promotersequenz zu Enhancer -Silencer: -hemmen die Transkription -an die Silencer binden Repressoren -Silencer sind von Promotor weit entfernt -Schleifen werden gebildet damit näher am Promotor befindet ->behindert die Bindung von TIC (Transkriptionsinitationskomplex) und somit auch der RNA-Polymerase

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Was ist ein Operon? -Genregulation von Prokaryoten (Mikroorganismen ohne Zellkern) spricht man vom sogenannten Operon-Modell - Das Operon: DNA-Abschnitt -> Promotor (Startstelle für die Transkription), Operator und mehreren Strukturgenen -Vor dem Operon: Regulatorgen, das für einen sogenannten Repressor codiert

Beispiel: lac.Operon -Negative Regulation: ->Repressoren binden an Operator und verhindern die Transkription

Operon off: -Genregulation durch Substrat-Induktion (negative Regulation) -Regulatorgen bildet ein aktives Repressorprotein (Regulatorgen ist vor dem Promotor) -Aktives Repressorprotein bindet am Operator -Keine Lactose vorhanden (aber Glucose) -Repressor bindet an Operator und verhindert die Transkription der Strukturgene =>kein Enzym wird gebildet (um Laktose ab zu bauen, weil auch keine vorhanden ist) Operon on: -Lactose ist vorhanden (keine Glucose) -Lactosemolekül bindet an der Repressor =>verändert Tertiärstruktur -Repressor kann nicht mehr an Operator binden =>Repressor ist inaktiv -Transkription kann stattfinden ->keine Blockade durch Repressor ->RNA Polymerase kann binden -Enzyme werden synthetisiert ->Enzyme für den Lactoseabbau ->durch Abbau wird Lactose in der Zelle verringert -Wenn keine Lactose mehr vorhanden ->Repressor bindet wieder an Operator 6

-Wichtig für abbauende Stoffwechselprozess, Genprodukt nur wenn es benötigt wird

Was ist genetisches Material? -DNA ist Träger der genetischen Information -genetische Material einige Voraussetzungen erfüllen: 1. Information 2. Überlieferung 3. Replikation 4. Variation -In verschiedenen Experimenten konnte als Träger der Erbanlagen DNA nachgewiesen werden

Was ist der Sigma-Faktor und welche Bedeutung hat dieser? -Es gibt viele σ-Faktor, so dass eine selektive Transkription von verschiedenen DNA-Bereichen möglich wird Z.B. σ70 (housekeeping-Faktor), σE (Stresssituation wie erhöhte Temperatur) -Sind Proteine -> für die Initiation der Transkription in Bakterien -Als transienter Faktor der RNA-Polymerase sind sie für die Erkennung und Bindung des Promotors verantwortlich -Weitere Form der Genregulation -Schnelle Reaktion auf äußere Einflüsse -Holoenzym: Innenteil ((Coreenzym): α2ββ’)+ σ (sigma Faktor) σ = Promoter Erkennung - Das Core-Enzym der prokaryotischen RNA-Polymerase besteht aus den Untereinheiten α, α, β, β' und ω (übliche Scheibweise ααββ'ω) -Assoziiert an das RNA-Polymerase-Holoenzym ist σ70 verantwortlich für die Erkennung und Bindung einer DNA-Sequenz innerhalb der -10- und -35-Promotorregion des zu transkribierenden Gens -Dadurch kann die RNA-Polymerase die Transkription an der Startstelle (Englisch: "start site") initiieren -Wenn RNA-Polymerase bindet und Transkription beginnt -> Sigma-Faktor löst sich ab

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Quellen: Vorlesung Einführung in die Molekularbiologie Dr. Michael Meltzer https://www.scienceabc.com/pure-sciences/avery-macleod-and-mccartyhershey-chase-dna-experiments.html https://www.studysmarter.de/schule/biologie/genetik/genregulation/ https://flexikon.doccheck.com/de/Sigma-Faktor

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