El centrómero y el telómero PDF

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EL CENTRÓMERO ¿Por qué el centrómero se comporta de forma tan particular? Los centrómeros son responsables de la unión de los cromosomas a las fibras del huso mitótico, consecuentemente de la migración de las cromátidas a los polos y por ello del reparto equitativo de la información genética en las células hijas. Sin duda esta función tiene que ver con la estructura que tienen los centrómeros y que a su vez estará determinada por las secuencias nucleotídicas y por la asociación con proteínas específicas. En las células de eucariotas superiores como las humanas los centrómeros de los cromosomas son estructuralmente complejos, anclándose el ellas durante las divisiones celulares varias fibras del huso por cada cromátida del cromosoma. El estrechamiento que supone la constricción primaria permite intuir que en esa zona la espiralización del cromosoma es diferente, que no tiene plegamiento en dominios ni lazos supra-dominios como los que se forman por la asociación de proteínas no histonas en otras zonas del cromosoma. Está compuesto fundamentalmente por heterocromatina pero es una heretocromatina especial (α) que aparece al centrifugar el ADN genómico en gradiente de densidad de cloruro de cesio formando un pico separado del resto y se le llamó ADN satélite α. Tratando de ver secuencias se encontró que entre dos bloques de satélite α hay una zona central de ADN que se asocia al cinetocoro (*) formando su placa interna en la que la secuencia no es siempre la misma pero en todos los casos la histona H3 está sustituida por una proteína centromérica, la CENP-A (parece que la sustitución es alterna, un nucleosoma sí y otro no produciéndose un plegamiento que hace que los nucleosomas sustituidos queden en la parte exterior en contacto con el cinetocoro). En total el centrómero de los cromosomas humanos tiene aproximadamente un millón de pares de bases de las que la mayoría son α heterocromatina formada por dos b loqu es de repeticiones en tándem de una secuencia corta (171 p. de b. aproximadamente). Entre los dos bloques de hete roc rom atin a alfoide e st á l a z o n a c e n t ral o corazón centromérico que es la única parte del centrómero en contacto con el cinetocoro. Con experimentos de desplazamiento de fragmentos se ha podido comprobar que las secuencias satélite α no son necesarias para la unión al cinetocoro.

Por otra parte en la zona central no se ha detectado una secuencia específica que justifique por sí sola la sustitución de la H3. Parece que el primer determinante de la funcionalidad del centrómero es epigenético, depende de cómo esté metilada las secuencias de la zona central. Los bloques de heterocromatina alfoide tendrían una doble misión de protección del centrómero y separación del resto del cromosoma y sobre todo para dar estabilidad a la zona centromérica. Dada la importancia de la sustitución de CENP-A por H3 y lo que ello puede modificar en los nucleosomas y la importancia de la secuencia de la central aunque no sea igual en todos los centrómeros de eucariotas superiores, parece recomendable ver ligeramente la estructura del centrómero de Saccharomyces cerevisiae, levadura sencilla para tener una idea cómo pudo ser el principio evolutivo del centrómero de los cromosomas humanos. Cuando Clarke y Carbon secuenciaron y analizaron el centrómero del cromosoma 3 de Saccharomyces cerevisiae (1985) las técnicas moleculares no eran tan potentes como en la actualidad ni se tenían secuenciados genomios enteros por lo que se arreglaron para suplir con inteligencia las dificultades. Eligieron como material biológico una levadura sencilla de la que se sabía que el centrómero de cada cromátida se unía a una sola fibra del huso. Se centraron en el centrómero del cromosoma 3 del que sabían que estrechamente unidos al centrómero se encontraban por un lado el gen LEU2 y por el otro el CDC10. Para seleccionar el fragmento que contuviese al centrómero se hizo una genoteca en plásmidos que introducidos en células eucarióticas se expresan como cualquier cromosoma pero como no tienen centrómero propio, si tampoco lo tenían en el segmento de la levadura introducido en el plásmido éste en las meiosis segregaba 4:0 (iba todo a un polo). Así seleccionaron los fragmentos que tenían centrómero y luego entre éstos volvieron a seleccionar los que tenían LEU2 y CDC10 con lo que aseguraban que llevaban el centrómero del cromosoma 3. Luego con deleciones determinaron cual era el segmento mínimo que tenía actividad centromérica y o partir de ellos y mediante la técnica de paseo cromosómico se pudo determinar la secuencia nucleotídoca del centrómero 3 (aproximadamente 220 pares de bases de las que sólo 125 parecen esenciales). La secuencia en sí ofrecía poca información, si es caso que la mitad central era extraordinariamente rica en pares A-T. Pero al tener el centrómero de un cromosoma fue fácil conseguir hibridando en blots los de otros cromosomas de la levadura y al comparar las secuencias se pudieron distinguir 3 elementos básicos que se repetían.

Llamaba especialmente la atención los elementos centrales (elemento II) de entre 78 y 86 pb que eran distintas en todos los cromosomas pero en todas ellas había entre un 91 y un 95% de pares A-T. El elemento I tenía la secuencia uTCACuTG pegada al elemento II en todos los cromosomas y, tam bié n pegada a II en el e lem en to III se enc on traba siste mátic ame nte la sec ue ncia TGTTT_TG_TTTCCGAAA____AAA. Clarke y Carbon proponen que estas secuencias permiten la asociación con una serie de proteínas específicas que pueden asociarse a la fibra microtubular del huso. El análisis de estas proteínas en los años siguientes trajo como consecuencia la publicación en el año 2000 de un modelo que en la actualidad se considera acertado. El núcleo o corazón nucleosómico es un octámero de histonas en las que H3 está sustituida por Cse4. Esta sustitución parece ser epigenética, o al menos es epigenético su mantenimiento ya que cuando Cse4 se localiza en otros puntos cromosómicos es eliminada mientras que en el centrómero está protegida contra la proteolisis. Así se forma un núcleo especializado al que se asocia el ADN en una sola lazada gracias a la secuencia altamente rica en A-T de CDE II y al concurso de una proteína centrómero-cinetocórica (Mif2). De esta forma el segmento de 220 pb rodea el corazón cinetocórico especializado utilizando el elemento II y deja próximos entre sí los elementos I y III. Cada uno de ellos tiene asociadas una serie de proteínas cinetocóricas con distintas funciones, desde unión a fosforilantes, y los dos grupos se asocian entre sí por el concurso de Cbf1p. En esta situación el centrómero con las proteínas asociadas es receptivo para que se una el complejo puente cinetocórico al que ya se puede anclar el microtúbulo.

Pero del centrómero hay todavía algunas cosas más que decir. La primera es que, sabido que el cromosoma metafísico tiene dos moléculas de ADN completas e idénticas, ¿qué las mantiene juntas, al menos a nivel centromérico hasta la metafase y luego permite que se separen en anafase? Y por último, pero no menos intrigante, ¿por qué en meiosis I la unión del huso al cinetocoro es sintélica y en mitosis es anfitélica? CONCEPTOS: Binomio estructura – función en el centrómero.- La constricción primaria de los cromosomas tiene una estructura única en el cromosoma que le permite realizar su principal función que es el anclaje de los cromosomas en el huso para asegurar el reparto equitativo

del material genético. La estructura de los eucariotas más sencillos está determinada por la secuencia y por la modificación de un corazón nucleosómico por sustitución de la H3. En los eucariotas superiores, sin que se haya podido encontrar secuencia alguna responsable de ello, hay varios nucleosomas modificados por sustitución de la H3, y son responsables de que el cinetocoro que se asocia sea más complejo y se una a su vez con varias fibras del huso. Además para proteger todo el segmento existe una acumulación a ambos lados del centrómero de heterocromatina, diferente a cualquiera otra heterocromatina del genomio. Unión cinetocoro de cromosoma metafásico – fibras del huso.- Cada cromosoma metafásico tiene dos cromátidas hermanas y en cada cromátida hay una estructura centromérica a la que se asocian una serie de proteínas formando un cinetocoro. Un cromosoma metafásico tiene dos estructuras cinetocóricas. Se dice que un cromosoma se ancla anfitélicamente al huso cuando a un cinetocoro se unen fibras de un polo y al otro cinetocoro fibras del polo opuesto. Cuando a los dos cinetocoros se unen fibras de un solo polo se dice que hay un anclaje sintético. Hay otros casos excepcionales; cuando sólo un cinetocoro se une a microtúbulos, si estos son de ambos polos se dice que el anclaje es mesotélico y si son sólo se un polo es monotélico. Como del anclaje depende la coorientación de los centrómeros y cromátidas se habla tradicionalmente de coorientación de centrómeros anfitélica (cada centrómero se va a un polo diferente, como ocurre en mitosis) y coorientación sintética de centrómeros (los centrómeros de las dos cromátidas hermanas van al mismo polo, como ocurre en la metafase i meiótica). Fragmentos acéntricos.- Un fragmento sin centrómero, p.e. un plásmido, en las divisiones no es arrastrado a la placa ecuatorial de la célula en prometafase ni separadas sus “cromátidas” a los polos en anafase. Es fácil que durante la citocinesis las dos copias se queden incluidas en el nuevo núcleo (el conjunto de las moléculas autónomas sin centrómero se repartirán más o menos entre los núcleos hijos y algunas se perderán por quedar fuera del núcleo y ser degradadas por nucleasas citoplasmáticas. Otra cosa es lo que pasa con los fragmentos acéntricos que se generan durante las divisiones; los cromosomas se llevan completos hasta el centro de la célula en metafase si luego (como consecuencia de recombinaciones asociadas a anomalías u otros procesos) se separa un fragmento acéntrico no emigra a los polos, tiene una probabilidad muy baja de integrarse en alguno de los núcleos de telofase y se pierden sistemáticamente. Tamaño mínimo.- Para que un trozo de cromatina se comporte como un cromosoma es necesario que tenga telómeros como se verá en la lección siguiente (o sea circular) para preservar su integridad y es necesario que tenga centrómero para asegurar el reparto equitativo en las células hijas de las divisiones celulares. Sin embargo cuando se hicieron cromosomas artificiales con estas estructuras no actuaban los centrómeros si no tenían en su conjunto un determinado tamaño. Sin que se sepa la causa, los centrómeros no actúan si no van acompañados de una cierta cantidad de material cromatínico. Paso de metafase a anafase.- Las cromátidas entran siempre en división replicadas completamente y a nivel del centrómero son completamente independientes las dos dobles hélices. Se mantienen unidas entre sí por el concurso de ciertas proteínas (cohesina) que son modificadas por proteasas después de la metafase por lo que al acortar las fibras del huso en anafase no hay ya impedimento alguno para que cada centrómero arrastre a su cromatida al polo correspondiente. En la primera división de meiosis los centrómeros de cromátidas hermanas tienen asociadas proteínas específicas que hacen que permanezcan uno al lado del otro (monopolin en S. cerevisiae, Rec8 entre otras proteínas en superiores). Estas proteínas están asociadas desde S premeiótico donde parece que se perpetúan por una procedimiento epigenético. La orientación a polos opuestos de centrómeros homólogos tiene que ver con la disposición de centrómeros y quiasmas aunque, lógicamente facilita el proceso el que exista cohesina, (que mantiene unidas las cromátidas hermanas) y unión estable de cinetocoros hermanos que desaparece en meiosis II. BIBLIOGRAFÍA ADICIONAL: -Hemmerich et al. (2000) P.N.A.S. 97, 12583 -Hauf and Watanabe (2004) Cell 119, 317-327

EL TELÓMERO Reciben el nombre de telómeros los extremos de los cromosomas. Los extremos de los cromosomas tienen una estructura diferente al resto que protege la integridad del cromosoma. El telómero no sólo protege la integridad del cromosoma Barbara McClintock (1938) demostró que la pérdida de la región distal de un cromosoma provoca que se fusionen las cromátidas hermanas, formándose a lo largo de las mitosis ciclos de fusión-puente-rotura. Supongamos que un cromosoma con una sola cromátida sufre una rotura con pérdida de un fragmento que incluye un telómero. En principio no ocurre nada más porque es muy improbable que encuentre cerca otro fragmento con el que pueda unirse, sin embargo, después del periodo S de la interfase el cromosoma pasa a tener 2 cromátidas y además éstas están muy próximas, una al lado de la otra, de tal suerte que con cierta facilidad las polimerasas pueden actuar sobre los extremos y unidos. En la mitosis siguiente el cromosoma tendrá las dos cromátidas de un brazo unidas en continuidad, se espiralizará normalmente y el centrómero por el cinetocoro se anclará a las fibras del huso. Las dificultades comenzarán con la migración de las cromátidas a los polos, ya que la continuidad de dos de ellas en un brazo provoca un puente anafásico. Este puente puede resolverse de dos maneras con el mismo resultado en ambas: la primera es que la tensión rompa las cromátidas continuas por un punto aleatorio y la segunda que el puente persista (supongamos que las cromátidas unidas fuesen largas) y cuando se forme la envoltura nuclear un segmento quede fuera del núcleo y se pierda. La consecuencia es la misma, en cada polo hay un cromosoma con una cromátida que tiene una pérdida de un segmento. Este segmento no es el mismo en los dos cromosomas (la rotura es aleatoria) y normalmente en un polo habrá un cromosoma con un nuevo segmento de menos y en el otro polo, además del segmento inicial perdido ahora se acumulará la duplicación de otro segmento. La consecuencia de este fenómeno es que se vuelve a empezar un ciclo fusión-puente-rotura en cada una de las células resultantes y así sucesivamente, pero además se van acumulando desequilibrios cromosómicos, normalmente por acumulación de pérdidas, que en organismos superiores (animales sobre todo) hace inviables los productos de las mitosis a la larga.

Con estas observaciones B. MacClintock postuló la adhesividad de los fragmentos cromosómicos (1934 y 1941) y sugirió que los cromosomas intactos están protegidos de los fenómenos de fusión y rotura por la presencia de telómeros. El estudio a nivel molecular tuvo grandes dificultades, el primer paso se dio en Tetrahymena thermophila protozoo ciliado que tiene un sistema de amplificación génica que le lleva a producir en un momento de su ciclo celular miles de micro-cromosomas con telómeros intactos que se aíslan fácilmente y permitieron obtener la secuencia del telómero: (TTGGGG)n. En análisis posteriores se determinó que el telómero humano tenía la secuencia (TTAGGG)n. Estas secuencias repetidas hasta las 15 kb. en humanos y asociadas a proteínas específicas conforman el telómero que protege al cromosoma. La replicación de los extremos cromosómicos plantea problemas en la hebra retrasada, concretamente en la reparación tras la eliminación del último fragmento de okazaki y, si existe, la síntesis del trozo entre este último cebador y el final de la secuencia, ya que la ligasa para reparar tiene que anclarse en los dos extremos en ADN Para entender mejor el proceso son de interés los siguientes datos. Telómero humano: repeticiones del hexanucleótido TTAGGG (2.500 veces aproximadamente) (El telómero humano tiene una longitud de hasta 15.000 pares de bases) Un cebador de ARN tiene entre 8 y 12 nucleótidos. La hebra retrasada se sintetiza en eucariotas por fragmentos de unos 200 nucleótidos (Tamaño medio de cebador + fragmento de okazaki = 210 nucleótidos). Además los modelos suponen que el punto de inicio de la replicación de la zona telomérica es intersticial (no comienza en el mismo extremo) y además siempre hay una secuencia final monocatenaria en el extremo 3’. Partiendo de un extremo con estas características la replicación al completarse produciría la doble hélice con molde 3’ – 5’ que replicaría hasta el extremo y otra doble hélice con molde 5’ – 3’ que dejaría sin replicar un trozo con algo menos de 210 nucleótidos (entre 8 y 10 del último cebador más el trozo que no puede formar un fragmento de okazaki por no tener tamaño suficiente.

En este punto los autores introducen la acción de una exonucleasa 5’ - 3’ no encontrada de momento, que dejaría los extremos 3’ de una sola hebra en las dos cromátidas de una longitud de entre 130 y 210 nucleótidos. Empieza a replicar un ADN con una determinada longitud y al final del proceso se obtienen dos ADNs, uno con igual longitud y otro más corto en el tamaño de entre 130 a 210 nucleótidos. Plegamiento y protección Estos extremos monocatenarios si estuvieran libres más que proteger la integridad del cromosoma la destruirían pues tenderían a unirse a cualquier otra monocadena con una secuencia ligeramente complementaria. Por eso se buscaron proteínas que se

asociasen específicamente a los telómeros y que pudiesen plegar el extremo sobre sí para autoprotegerse. Conforme se iban encontrando nuevas proteínas los modelos se fueron modificando, aceptándose en la actualidad como factible el de bucle T y bucle D elaborado por Griffiths y colaboradores que postula que el plegamiento se produce por la interacción del extremo del cromosoma (doble hélice y zona monocatenaria) con proteínas específicas TRF1 y TRF2 (Factor de unión de Repeticiones Teloméricas 1 y 2 respectivamente). La TRF1 se une a las repeticiones en doble hélice favoreciendo su plegamiento. La TRF2 también actúa como TRF1 pero además se encuentra asociada al fragmento monocatenario. La TRF1 asociándose dos veces a la doble hélice la pliega de modo que el extremo queda paralelo a la zona junto antes del plegamiento. Así y con el concurso de la TRF2 la zona monocatenaria interfiere con la doble hélice y desplaza la cadena con su misma polaridad, cerrando el extremo del cromosoma sobre sí.

Teniendo en cuenta que cada cromosoma tiene 2 telómeros y cada célula somática 46 cromosomas cuyas cromátidas cortas y largas migran a las células hijas de forma aleatoria, en pocas divisiones se tendrá una población de telómeros de muy diversos tamaños. Por otra parte dado que el telómero humano tiene unos 15.000 p.b. si se pierden entre 130 y 210 nucleótidos por generación en la mitad de las células hijas, al cabo de unas pocas generaciones las células perderían sus telómeros; tiene que haber un sistema de regeneración de las secuencias repetidas de los extremos de los cromosomas. Se postuló la existencia de un enzima específico “telomerasa” que actuaría corrigiendo el acortamiento de las replicaciones, se buscó de nuevo en Tetrahymena que producía gran cantidad de telómeros y se pudo aislar encontrando que era bastante peculiar. La telomerasa agrega secuencias TTGGGG en el 3’ y para hacerlo tiene un molde propio de ARN (450 nucleótidos aproximadamente) que tiene en su parte media unas 9 repeticiones de la secuencia AACCCC (AATCCC en humanos). Es una ADN polimerasa ARN dependiente o como se decía antes es una transcriptasa inversa*. Su modo de acción es el siguiente: la proteína de la telomerasa se acopla al extremo monocatenario de tal manera que el ARN de la telomerasa puede unirse por complementariedad de bases a la cadena sencilla de ADN; a continuación la siguiente repetición del ARN actúa de molde y la proteína con acción ADN polimerasa alarga la cadena 3’ del ADN. El paso siguiente es el movimiento de toda la telomerasa e inicio de un nuevo ciclo. Cuando se trató de localizar la telomerasa en distintos tipos celulares se encontró en la línea germinal perfectamente activa y consecuentemente en estas células se mantiene el tamaño de los telómeros. Sin embargo en las células somáticas no se encontró rastro de telomerasa activa. Puede tomarse como una norma general que las células embrionarias tienen actividad telomerasa y por tanto no reducen su tamaño de telómeros; también que las células tumorales (salvo casos especiales que se explican por recombinación) recuperan la actividad telomerasa en niveles similares a los de células embrionarias. Frente a ellas en general l...