Esperimento di Hershey e Chase, viroidi e pironi PDF

Preview

Summary

Download Esperimento di Hershey e Chase, viroidi e pironi PDF

Description

! " " " " " " " " " " " " "GENETICA MOLECOLARE, prof. Anna Olivieri ! esperimento di HERSHEY e CHASE 1952! è l’esperimento decisivo che dimostra che il DNA è la molecola della vita. ! L’organimo modello utilizzato è il batteriofago T2. La scelta ricade su un batteriofago per la facilità con cui si sarebbero poi svolte le analisi ! • uno degli organismi più semplici esistenti! • ciclo vitale altrettanto semplice! ! parliamo di ciclo litico 1. il batteriofago aderisce (adsorbe) alla membrana del batterio ospite e inietta all’interno di esso il cromosoma fagico, il proprio materiale genetico di cui si sta indagando la natura ! 2. questo causa la degradazione del genoma dell’ospite mediante enzimi specifici! 3. sfruttando le strutture presenti nel batterio il cromosoma fagico si replica più e più volte ! 4. avviene dunque l’espressione di geni del fango che ne producono le componenti strutturali! 5. una volta completato l’assemblaggio della progenie fagica ! 6. avviene il rilascio della progenie in seguito alla lisi della parete batterica! ! struttura del batteriofago è costituito esclusivamente da due elementi ! • capside proteico (proteine)! • un cromosoma al suo interno (DNA)! ‣ è l’organismo perfetto per risolvere il dubbio in questione. ! ! Partendo dal presupposto che che gli acidi nucleici contengono fosforo mentre le proteine zolfo (ricorda esperimento di MIESCHER), questi elementi vengono marcati con sostanze radioattive:! • le proteine furono marcate con 35S (zolfo 35)! • il DNA fu marcato con 32P! ! ! ! Dunque vengo condotti in parallelo due esperimenti analoghi lasciando infettare Escherichia coli una volta con il fango marcato con 32P e l’altro con 35S.! ! Con l’impiego di un frullatore, strumento decisamente rudimentale ma geniale, vengono separati i rivestimenti fagici dalla cellula infettata. ! ! Il centrifugato era costituito dunque dal precipitato che conteneva le cellule, più pesanti, e dal surnatante nel quale rimangono le ombre fagiche, gusci proteici vuoti e più leggeri. (procedimento identico)! !

PER COMPRARE GLI APPUNTI COMPLETI DI GENETICA O DI ALTRI INSEGNAMENTI CONTATTARE 3395449322. SPERO POSSANO ESSERERVI DI AIUTO :D

! A questo punto viene misurata la radioattività:! • nel primo esperimento viene indagata dov’è contenuta la radioattività del 32P! • nel secondo esperimento viene indagata dov’è contenuta la radioattività del 35S! ‣ all’interno delle cellule batteriche del precipitato cellulare! ‣ all’interno delle teste fagiche del surnatante ! ! la molecola della vita deve necessariamente essere il DNA. Partendo dal solo materiale genetico iniettato, una volta avvenuta l’infezione, vengono tradotte e trascritte le istruzioni che portano alla formazione di nuove proteine strutturali del virus.! ! In realtà Hershey e Chase trovarono nelle cellule una piccolissima quantità anche di 35S dovuta all’incompleta rimozione delle particelle virali assorbite alla parete dei batteri. Questa piccola “imperfezione” dipendeva ancora una volta dalla mancanza di tecniche più sofisticate.! Ad esempio oggi si può rimuovere la parete cellulare di un batterio ottenendo dei protoplasti che hanno solo la membrana cellulare (il doppio strato di fosfolipidi).! I protoplasti si possono inoculare con DNA fagico nudo (non quindi con una particella virale ma solo con il suo DNA) in una procedura detta “trasfezione”. Il risultato della trasfezione di protoplasti con DNA fagico è identico all’infezione di una cellula integra con una particella virale e cioè la lisi dei batteri e la produzione di una progenie di fagi. La trasfezione è la dimostrazione inequivocabile che il DNA è il principio trasformante (in grado i ricostruire il virus)! ! eccezioni, esperimento di GIERER e SCHRAMM 1956 dimostra che alcuni organismi utilizzano come materiale genetico l’RNA. Infatti questi scienziati dimostrano che piante inoculate con solo RNA estratto dal virus del mosaico del tabacco sviluppano lesioni tipiche indotte dal trattamento col virus TMV integro. ! ! Dal punto di vista tecnologico è un esperimento più avanzato e passa attraverso la ricostruzione di un virus in provetta. Questo è costituito da 2 soli componenti, un rivestimento proteico e il materiale genetico. In particolare l’RNA codifica per le proteine specifiche del proprio tipo: riconosciamo infatti due varianti del virus, A e B. ! ! Vengono dunque costruiti in vitro virus TMV ibridi ! • una forma che contiene RNA di tipo A e rivestimento proteico di tipo B! • viceversa, una forma che contiene RNA di tipo B e rivestimento proteico di tipo A! ‣ con questi ibridi hanno infettato la foglia del tabacco! ‣ a seguito dell’infezione la progenie che si veniva a sviluppare dipendeva sempre dal tipo di RNA e non dal tipo di involucro proteico ! ‣ viene dimostrato che, in questo caso, è l’RNA la molecola della vita, le proteine sono il prodotto specifico del genoma ‣ se fossero state le proteine la molecola della vita l’infezione avrebbe dipeso dal tipo di rivestimento proteico ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !

!

viroidi e prioni, la questione dei non-organismi Sono molecole che hanno acquisito una capacità infettiva ereditabile pur non possedendo un genoma. Sono agenti patogeni che costituiscono una categoria non perfettamente isolabile in quanto presentano una struttura differente e ancora più semplice dei virus ed esulano quindi da quanto detto riguardo la molecola della vita.! ! viroidi Il viroide è formato da un RNA “nudo" e quindi privo di involucro proteico. Non può essere quindi definito un virus. Sono agenti molto rari e indicati come fitopatogeni poiché causano gravi malattie delle piante, ad esempio il PSTV causa la malattia del tubero fusiforme nella patata.! ! L’RNA è di dimensioni decisamente ridotte rispetto a quello dei virus e l’infezione avviene silenziando l’espressione genica dell’ospite. L’RNA si lega al genoma della pianta causandone il silenziamento di alcuni geni. In sostanza viene svolta un’attività replicativa dell’RNA all’interno delle cellule infettate.! ! prioni I prionei invece sono agenti proteici infettivi che causano gravi malattie neurodegenerative al sistema nervoso centrale (definite genericamente come encefalopatie spongiformi subacute o ESS). La loro dimensione estremamente piccola facilita il passaggio della barriera ematoencefalica. Un prione è stato l’agente infettivo che ha provocato la sindrome della mucca pazza a fine anni novanta.! ! Il prione è una normale proteina cellulare che molto raramente assume un forma alterata patologica in grado di infettare e propagarsi pur non essendo di fatto un organismo. ! Si possono contrarre i prioni alterati e ammalarsi di conseguenza sia verticalmente (da madre al feto) che orizzontalmente mediante ad esempio l’ingestione di alimenti che li contengono (come la carne dei bovini colpiti dalla sindrome della mucca pazza).! ! Ci si imbatte in questi non-organismi già negli anni 70’ da uno scienziato che descrisse per primo una malattia da prioni, il kuru, senza però sapere niente dei prioni stessi. La malattia nervosa si osservava in alcune popolazioni indigene della Nuova Guinea. Egli scoprì che la trasmissione di questa patologia era orizzontale e dovuta ad un’usanza di cannibalismo praticata durante un rito tipico, che consisteva nel consumo dei cervelli dei defunti.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !...