: Experimento 02 – Bioquímica Experimental REAÇÕES DE CARACTERIZAÇÃO DE AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS. PDF

Preview

Summary

Nesse experimento tem-se a proposta de realizar uma serie analises a fim de
caracterizar proteínas e aminoácidos, estudar as ligações peptídicas e a solubilidade delas em
meios com diferentes pH’s, solventes, com a adição de sais e outros compostos.
Também será proposta a aferiç...

Description

FACULDADE DE FILOSOFIA CIÊNCIAS E LETRAS - FFCLRP - DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

EXPERIMENTO 2 REA ÇÕES DE CA RA CT ER IZ A ÇÃ O DE A M INOÁ C IDOS E PR OT EÍNA S

Júlia Mendonça Margatho N USP: 11217343

Tiago Manoel Tito Martins N USP: 11320582

Bioquímica Experimental

Docentes: Professor Doutor Arthur Henrique Cavalcante de Oliveira Professora Doutora Taisa Magnani Dinamarco

1 - Resultados e discussões A - Reações de precipitação de proteínas A1- Reação com biureto Nessa parte do experimento foi possível observar a diferença qualitativa das amostras apresentadas em relação a coloração: Tubo 1 – ovoalbumina (Violeta/lilás) Tubo 2 – gelatina (Violeta/lilás) Tubo 3 – glicina (Azul claro) Pode-se observar que a reação do Biureto com as amostras ocorreu de forma diferente, e assim é possível identificar a presença de proteínas na amostra 1 e 2, visto que o biureto é formado por cobre e hidróxido de sódio, assim o cobre presente reage com as proteínas das amostras, graças ao meio alcalino produzido pela adição de NaOH, formando um complexo quadrado planar com duas ligações peptídicas. No tubo 1 e 2 da positivo para a reação com biureto, pois quando se tem 2 ou mais aminoácidos espera-se que esses formem um complexo de coordenação entre o cobre e os átomos de nitrogênio das ligações peptídicas adjacentes, tornando a coloração da amostra roxa ou violeta, como foi observado, uma vez que no tubo 1 e 2 tanto a ovoalbumina quanto a gelatina são proteínas. Já no tubo 3, isso não ocorre, temse então um negativo para a reação com biureto, visto que a Glicina é um aminoácido e não apresenta ligação peptídica, não complexando com o cobre, mantendo a cor azul do sulfato de cobre II em meio alcalino. A reação que ocorre no tubo, como descrita anteriormente, é a formação do complexo entre o Cu+2 e a ligação peptídica dos aminoácidos, isso ocorre pois no grupo amino tem-se o par de elétrons dos átomos de nitrogênio livres, podendo servir de ligante para o átomo de cobre II. Complexo apresentado abaixo:

Essa reação é importante para algumas análises bioquímicas como a determinação da concentração e identificação de proteínas em plasma sanguíneo, saliva, urina, alimentos, tecido animal, etc.

A2- Reação com Acetato de Chumbo: Nessa parte do experimento pode-se realizar a análise das amostras pós adição de NaOH 6M e Acetato de Chumbo 1%. Observa-se que as amostras 2 e 3 ficam pretas e formam precipitado já a amostra 1 fica transparente. Isso porque, na adição de acetato busca-se identificar proteínas e aminoácidos que contenham átomos de enxofre em sua estrutura, o que só ocorre com os fios de cabelo e a ovoalbumina, pois essas apresentam aminoácidos como a cistina e a metionina que possuem ligações dissulfeto que reagem com o Chumbo, diferente da gelatina que não possui esses aminoácidos em sua composição, por isso deu negativo para o teste. A composição do sólido formado nas amostras 2 e 3 ocorre devido a reação das proteínas das amostras em meio básico que liberam enxofre que é precipitado e reage com o Pb+2 formando PbS, sulfeto de chumbo II, de coloração escura. Essas proteínas que contém aminoácidos sulfonados encontram-se apenas no cabelo e na ovoalbumina, como a Cisteína e a Metionina, descritas a seguir:

B- Reações de precipitação de proteínas B1- Efeito de ácidos fortes Nesse experimento observa-se que a adição de ovoalbumina em dois ácidos diferentes (HNO3 e HCl) reagem, também, de forma diferente. No tubo 1 com HNO3 observa-se um precipitado denso de cor amarelada, enquanto no tubo 2 observa-se um sobrenadante esbranquiçado. O que se espera nessa análise é observar a desnaturação proteica, visto que os ácidos concentrados adicionados não rompem as ligações peptídicas, mas desestabilizam as cargas no interior da molécula, alterando a estrutura terciária e secundária. A aparição do precipitado branco na interfase do tubo é devido a desnaturação da proteína da ovoalbumina, que só ocorre pois as proteínas globulares mantém sua estrutura terciaria através da atração eletrostática entre íons positivos de aminoácidos como Lisina e Arginina e os íons negativos como Glutamato e Aspartato, quando se adiciona ácido concentrado a amostra os íons carboxilatos do Aspartato e do Glutamato são protonados, perdendo sua carga negativa, o que quebra as interações eletrostáticas desorganizando a estrutura terciária da proteína, tornando a proteína insolúvel em água pela exposição do grupo hidrofóbico. B2- Precipitação fracionada por soluções salinas concentradas Nessa parte do experimento pode-se analisar a amostra de ovoalbumina em solução saturada de (NH4)2SO4, onde observa-se após todo processo a obtenção de uma amostra esbranquiçada com precipitado branco e depois de dissolvido uma reprecipitação. O que ocorre é que em baixas quantidades de sal na amostra de ovoalbumina ocorre apenas um aumento na força iônica do sistema, devido a dissociação do sal passam a interagir com as moléculas proteicas , aumentando a solubilidade da proteína no meio, fenômeno conhecido como “salting-in”. No entanto, com a adição do sal após a centrifugação e adição de água destilada o efeito é oposto, “salting-out”, nesse caso a água passa a interagir com duas espécies as proteínas e os íons da dissociação do sal, no entanto, a água tem preferência por solvatar partículas menores, assim as proteínas interagem mais entre si fazendo com que a solubilidade do meio diminua e a proteína precipite.

B3- Precipitação por Acetona Nesse experimento deve-se usar os seguintes dados para realizar a análise de cada caso.

Observando o resultado com as imagens oferecidas, pode-se atentar que a amostra dos tubos 1 e 2 ficam transparentes, enquanto as amostras do tubo 3 e 4 ficam esbranquiçados, sendo o 4 mais que o 3. Isso ocorre, pois, a acetona é um solvente orgânico apolar, isso faz com que as proteínas que originalmente se organizariam com sua estrutura hidrofóbica internamente e hidrofílica externamente, mude essa configuração obtendo a região apolar hidrofóbica externa agora interagindo cada vez mais com o solvente, o que garante a precipitação gradual da proteína quanto maior a adição do solvente, no caso no Tubo 4 onde a precipitação é realmente observada....