Genoteca - Riassunto Tecniche biomolecolari applicate PDF

Preview

Summary

Genoteca...

Description

Obiettivi:

·

costruire mappe fisiche e genetiche (posizione dei geni sui cromosomi)

·

generare e ordinare sequenze genomiche e sequenze espresse

·

identificare ed annotare un set di geni codificato all'interno di un genoma

·

compilare gli atlanti di espressione genica: identificare funzione genica e gene candidato in un processo biologico

·

accumulare dati funzionali dei geni: genomica, proteomica, genomica strutturare, tossicogenetica ecc

·

caratterizzare la diversità delle sequenze di DNA

·

stabilire banche dati integrate ad una interfaccia web di ricerca

·

fornire risorse per comparazioni con altri genomi

Due sono state le strategie utilizzate per il sequenziamento:

1. ordine gerarchico "clone by clone" -15anni: digestione del genoma e suddivisione in sottogruppi -> Libreria con inserti cromosomici. Clonaggio in vettori BAC, PAC e cosmidi -> costruzione mappa fisica del genoma, selezione del numero minimo di cloni per coprire il genoma -> frammentazione casuale e sequenziamento shotgun dei cloni e loro assemblaggio a formare "contigs" -> assemblaggio "contigs" e ricostruzione delle sequenza >>Mappa fisica

2. I BAC vengono selezionati e purificati dalle corrispondenti colonie batteriche

3. Il DNA purificato viene frammentato, frammenti di 2-5 kb sono clonati in plasmidi

4. I frammenti vengono sequenziati col metodo Sanger 5. Le sequenze generate sono chiamate "reads" 6. La sequenza che si forma dalla sovrapposizione di reads è detta "coting"

7. Le coting, nell'assemblaggio finale, sono intervallate da gaps (regioni non coperte, ignote; sequenze ripetute, invertite)

8. WGS Genoma "shotgun" (di getto) -2anni: inserti 1.5-3 kb; frammentamento genoma, clonaggio, sequenziamento e assemblaggio delle sequenze. La presenza nel genoma eucariotico di sequenze ripetute crea problemi nell' assemblaggio delle sequenze. L’approccio shotgun a genomi di grandi dimensioni pone diversi problemi di assemblaggio: - al crescere del numero dei frammenti aumenta enormemente il numero di overlap possibili, creando notevoli problemi computazionali; - la presenza di regioni ripetute può determinare errori di assemblaggio con perdita di sequenze o unione erronea di frammenti, appartenenti anche a cromosomi diversi; - il numero di gap finali da chiudere diviene molto alto. Pertanto, il metodo shotgun non è adeguato al sequenziamento completo di genomi complessi. ->Rifiniture del sequenziamento. Le lacune vengono risolte in più passaggi: * inserzione di sequenze * associazione degli scaffold alla struttura genomica via STS (Sequence Tagged Sities) -> STS èuna corta sequenza di DNA facilmente individuabile e ricorre una sola volta in un genoma o cromosoma. In seguito alla frammentazione, la probabilità che due STS siano localizzate sullo stesso frammento sarà proporzionale alla loro distaza fisica sul genoma. Strategia di sequenziamento:

·

WGS: organismi batterici o eucarioti monocellulari con genomi piccoli (...