Tecniche Spettroscopiche PDF

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TECNICHE SPETTROSCOPICHE Le tecniche spettroscopiche sono tutte quelle basate sull’interazione tra la materia e le radiazioni elettromagnetiche. La luce, il calore ed altre radiazioni elettromagnetiche sono vibrazioni di campi magnetici ed elettrici che si propagano nello spazio. Ogni radiazione è caratterizzata dai parametri: Frequenza (n), numero di vibrazioni nell’unita di tempo Lunghezza d’onda (l), distanza tra due punti adiacenti in fase (ES. due massimi consecutivi) Velocità di propagazione (c) nel vuoto, è la velocità della luce. La relazione che li lega è = c/v c = 3 ×108 m s−1

Esistono vari tipi di radiazione elettromagnetica, che differiscono per la loro lunghezza d’onda e quindi per la loro frequenza ed energia.

Atomi e molecole possono assorbire quantità definite di energia. Quando vengono eccitati da specifiche radiazioni elettromagnetiche passando a stati energetici maggiori, si ha l’ ASSORBIMENTO. Quando gli atomi eccitati ritornano allo stato fondamentale ed emettono quanti di energia sotto forma di radiazioni, si ha l’EMISSIONE. Ogni sostanza assorbe o emette radiazioni di lunghezza d’onda ben definita, il CROMOFORO è la porzione della sostanza assorbente interessata a tali transizioni ed è costituita da: anelli eterociclici aromatici; doppi legami; ponti disolfurici; gruppi chimici funzionali Il colore visibile è quella parte di luce non assorbita. APPLICAZIONI DELLA SPETTROFOTOMETRIA Analisi qualitativa: analisi dello spettro per individuare natura della sostanza. Analisi quantitativa: misura dell’intensità delle radiazioni emesse o assorbite per risalire alla quantità di sostanza. Analisi quantitativa diretta: per sostanza che assorbono ad una data lunghezza d’onda (lambert-beer) Analisi quantitativa indiretta: tramite reazione colorimetrica Attività cinetica enzimatica: si misura la velocità di comparsa o scomparsa di una sostanza come substrato o prodotto.

ANALISI QUALITATIVA Lo SPETTRO è una curva ottenuta congiungendo i valori di assorbimento in funzione della lunghezza d’onda in un certo intervallo. Ogni sostanza assorbente ha un suo caratteristico spettro utile. L’uncità dello spettro consiste nella presenza di caratteristici picchi di assorbimento a determinate lunghezze d’onda. Esempio è lo spettro del coenzima NAD+ NADH ha picchi a 260 e 340 nm NAD+ ha un solo picco a 260 nm

ANALISI QUANTITATIVA DIRETTA (LAMBERT-BEER) Le determinazioni quantitative sono basate sul fatto che, quando una radiazione attraversa una soluzione viene assorbita più o meno intensamente a seconda della concentrazione; l’assorbimento dipende quindi dalla concentrazione. I con 0 = intensità della radiazione incidente I = intensità della radiazione trasmessa Trasmittanza T = I/I con 0 Grafico: andamento dell’assorbimento e della linearmente con la esponenzialmente.

trasmittanza. L’assorbimento cresce concentrazione, la trasmittanza decresce

0≤T≤1 T = 1 la radiazione è

completamente trasmessa I con 0 = I

T = 0 la radiazione è

completamente assorbita I = 0

Si definisce A (assorbanza) = log I con 0/I = log 1/T RELAZIONE LAMBERT-BEER

VALIDITA LEGGE DI LAMBERT-BEER

La luce incidente è monocromatica; l’assorbimento del solvente è trascurabile; la concentrazione del campione è entro limiti adatti; non si verificano reazioni tra molecole del campione fra loro o con solvente. ANALISI QUANTITATIVA INDIRETTA 

Metodo del Biureto

Il reattivo del biureto è costituito da una soluzione di solfato di rame contenente tartrato di sodio e potassio. In condizioni alcaline gli ioni rameici Cu2+ formano un complesso di coordinazione con quattro gruppi NH presenti nei legami peptidici. Il complesso che si forma assorbe luce nel visibile con un picco a 550nm 

Metodo Bradford

Il legame del colorante coomassie brillant blue alle proteine ( a residui di arg, trp, tyr, ist, fnl) in forma anionica determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 460nm (rosso) a 595nm (blu) in soluzioni acide. La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina in soluzione. L’intensità del colore blu (e quindi l’assorbimento) è proporzionale alla concentrazione proteica. In genere quantità uguali di proteine diverse legano la stessa quantità di colorante ==> il saggio non dipende dal tipo di proteina. 

Entrambi i metodi necessitano di un valore di riferimento, la concentrazione dell’albumina dosata a 280nm

ATTIVITA’ E CINETICA ENZIMATICA L’attività enzimatica è espressa in base alla velocità della reazione promossa dall’enzima Katal (SI): quantità di enzima che converte 1 mol substrato in 1 sec (mol/sec) Unità internazionale (UI): quantità di enzima che converte 1 µ mol substrato in 1 min a T, pH e forza ionica definita (µmol/min) Fattori da cui dipende attività enzimatica: Concentrazione substrato, temperatura, pH, forza ionica, presenza di altre molecole. Velocità di reazione v = -d [ S ] / d T = d [ P ] / d T pro

Variazione nel tempo di concentrazione sub o Occorre che substrato e prodotto abbiano assorbimenti diversi in qualche zona spettrale, se ciò non si verifica bisogna usare un metodo accoppiato

SPETTROFLUORIMETRIA La fluorescenza è un fenomeno di emissione. La transizione di energia da uno stato più alto ad uno più basso è accompagnata da un’emissione di radiazione. La della radiazione di assorbimento deve essere più bassa (energia più alta) di quella emessa (fluorescenza). La differenza tra le due  è nota come Shif di Stokes. Fosforescenza, simile ma l’emissione ha un tempo di decadimento più lungo e persiste anche quando l’eccitazione è terminata. Shif Stokes è la differenza tra le lunghezza d’onda corrispondenti al massimo dell’assorbimento e al massimo dell’emissione. MISURE Un quanto è pari all’energia necessaria per permettere il salto di un elettrone, l’efficienza quantica Q è il rapporto tra i quanti emessi per fluorescenza e i quanti assorbiti ed è indipendente da lunghezza d’onda della luce di eccitamento. A basse concentrazioni vale la reazione  = resa quantica = fotoni emessi/ fotoni assorbiti La sensibilità dipende da  di lambda e da  Dove c= concentraizone molare del composto fluorescente; d=cammino ottico in cm della sol. Fluo. ; =coefficiente di estinzione molare del composto che assorbe a lunghezza d’onda  FATTORI CHE INFLUENZANO RESA QUANTICA pH; temperatura (all’aumentare di T diminuisce ); polarità del solvente; Quenching (fenomeno di smorzamento della fluorescenza dovuto all presenza di altre sostanze in soluzione che riducono la luce emessa Quenching dinamico: interazioni con lo stato eccitato del fluorofloro Quenching statico: interazioni con lo stato fondamentale del fluoroforo FLUORESCENZA VANTAGGI E SVANTAGGI    o

Sensibilità Selettività Relazione semplice tra F e concentrazione Non si può prevedere se una molecola è fluorescente o Dipende dalle condizioni ambientali o Effetto filtro ad alte concentrazioni o Bleaching, sbiancamento APPLICAZIONI FLUORIMETRIA/SPETTROFLUORIEMTRIA Analisi quantitativa/ qualitativa Studi proteine

Studi di legame FRET Misure di quenching Dosaggi enzimatici e analisi cinetiche Sonde fluorescenti e struttura membrane Fluorofori naturali e coenzimi: TRIPTOFANO, TIROSINA, FENILALANINA, FAD, NADH Fluorofori estrinseci: BROMURO DI ETIDIO, DANSILE Sonde per acidi nucleici:  INTERCALANTI: bromuro di etidio e DAPI Il bromuro di etidio (propidio ioduro) normalmente non può attraversare la membrana cellulare, se ci riesce la cellula è danneggiata o in fase di morte. Può essere intercalato nel DNA e quando si lega, esposto alla luce ultravioletta, emette fluorescenza di colore rosso-arancione Cyber green: questo complesso DNA colorante assorbe luce blu ad una lunghezza d’onda di 488nm ed emette luce verde a 522nm Proteina con fluorescenza verde (GFP): isolata da medusa bioluminescente aequorea victoria emette fluorescenza a 508nm dopo essere stata esposta a luce ultravioletta FRET Sovrapposizione degli spettri di donatore ed accettore, vicinanza (1-10nm), alta resa quantica del donatore. Si possono esprimere proteine ricombinanti con proteine fluorescenti come GFP. Il trasferimento di energia di risonanza si può avere quando donatore e accettore sono distanti meno di 100 Angstorm uno dall’altro. L’energia trasferita non è radiativa, che significa che il donatore non sta emettendo fotoni assorbiti dall’accettore. FRET può essere usata per effettuare uno spostamento spettrale della fluorescenza emessa di un composto. Il meccanismo utilizza un fluoroforo donatore in uno stato eccitato, che può trasferire la sua eccitazione. L’interazione è di tipo non radiativa attraverso interazioni dipolo-dipolo a lungo raggio.

Real time PCR Determina in maniera precisa, in tempo reale, l’amplificazione PCR degli acidi nucleici targets. Questo tramite l’utilizzo di vari composti di rilevamento fluorescenti. Questo permette la quantificazione delle sequenze del DNA ....