Appunti lezione 8 su ChIP - Tecniche biomolecolari applicate a.a. 2013/2014 PDF

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Appunti lezione 8 su ChIP - Tecniche biomolecolari applicate a.a. 2013/2014...

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Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)

Approcci tradizionali al problema - Determinazione sperimentale dei siti di legame dei fattori di trascrizione. EMSA, DNAse footprinting - in vitro - Previsione computazionale dei motivi di legame. Ma un motivo può essere un vero e proprio sito di legame? - Analisi di DNA microarray di geni bersaglio. Ma il bersaglio è diretto o indiretto?

Da queste domande:

nasce la necessità di un metodo più diretto in vivo.

Applications of ChIP, ChIP-Chip, and ChIP-Seq • Target Gene Identification (individual and global) • Binding Site Consensus Identification • RNA--DNA--Protein Interactions • Analysis of Epigenetic Phenomenon (eg, methylation, silencing)

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) La tecnica prevede l’identificazione di specifiche regioni/ sequenze di DNA associate con una proteina di interesse, in vivo. È diventato un potente strumento per analizzare le interazioni proteina/DNA, capace di rilevare qualsiasi segnale/modifica associato con il DNA / cromatina.

Ha avuto un enorme impatto sullo studio della cromatina, nell'epigenetica.

La Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) consiste in diverse fasi

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 1. Crosslinking with Formaldehyde

Optimization is crucial.

Starting ChIP   Treat cells with formaldehyde: protein-protein and protein-DNA cross-links stop transcription factors in their tracks (DAY 0)

Cross-linking can be done on: • Suspension cells • Adherent Cells • Tissues • Anatomical structures

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 2. Cell lysis and sonication

Sonication using the BioRuptor!

ChIP--Day 1

Sonication Check 31 pulses

21 pulses

11 pulses

6 pulses

Sonication results in many different sized fragments and should be verified for your experiment

10 kbp

3 kbp 500 bp 100 bp

Fragment size limits for Qiaquick PCR Purification Column is 100 bp - 10 kb.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 3. Immunoprecipitation (IP)

The protein of interest is immunoprecipitated together with the crosslinked DNA

Immunoprecipitation (DAY 1 & 2) • 

Antibodies are Y shaped molecules with binding sites for specific antigens.

•  The heavy chain can come in several different classes. •  Hundreds of Abs to transcription factors are commercially available

Antibodies and DNA Positive Control: mouse anti-PolII primary with rabbit anti-mouse IgG secondary

2°

Negative Control: Nonspecific Rabbit IgG with rabbit antimouse IgG secondary

2°

1°

2°

Antibody Validation Step 1: Show reactivity on a Western (denatured epitope).! ! Step 2: Show IP ability. Perform IP, run Western and re-probe with same Ab (IPWestern)!

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 4.Decrosslinking and purification of the DNA

Reverse the crosslinking

Elution and Crosslink Reversal 1)  L’aggiunta di NaHCO3/SDS causa il rilascio dell’anticorpo dalla proteina (es. Un fattore di trascrizione) (DAY 2) 2)  0.2 M NaCl a 65º per 3 h (o più) reverte il crosslink. Dopo il reverse crosslink I frammenti di DNA sono liberi in soluzione (DAY 2) 3)  RNase A viene aggiunta, nel campione, per digerire l’RNA (DAY 3) 4)  Qiaquick PCR Purification kit è usato per purificare il DNA da utilizzare per la PCR, paragonando l’Ab positivo, l’Ab negative, e l’Input (DAY 3)

PCR di verifica della ChIP (DAY 3) Verifica che: 1)  La ChIP di controllo (PolII) è maggiore per il promotore target paragonato all’imput, il contrario si vede nel controllo negativo paragonato all’input. 2) Il controllo positivo l’Ab (polII) è maggiore rispetto al controllo negativo sul promotore target. M 1

2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

PolII Primers

DHFR3ʼ ʼ UTR Primers

promotore target

Lane

Sample

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.  12.

MW 1 ul polII ChIP 1 ul IgG ChIP 1 ul 0.004% Input 1 ul 0.02% Input 1 ul 0.2% Input 1 ul polII ChIP 1 ul IgG ChIP 1 ul 0.004% Input 1 ul 0.02% Input 1 ul 0.2% Input MW

Efficiency of ChIP No Ab (or IgG supernatant) 10 ul Input 10% Input

Reverse crosslinks QIAquick purify Elute in 50 ul EB

Sonicated Chromatin 100 ul (eg) 100% Input

PCR

10% Input

1 ul 0.2%

(positive control)

1 ul 1:10 0.02%

1 ul 1:50 0.004%

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) Controllo della ChIP -  Input DNA: la cromatina processata come gli altri campioni, tranne per lo step di IP. -  Specific antibody -  No antibody control (IgG): la cromatina processata con gli altri campioni e IP senza uno specifico Ab.

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) 5. Analysis of ChIP DNA Identificazione della regione di DNA associata con la proteina /modifica d’interesse: -  real-time PCR -  DNA microarray (ChIP-chip) -  Sequencing (ChIP-seq)

ChIP Chromatin Immunoprecipitation Application

DNA-binding proteins   Constitutive proteins (mostly histones)   Organize DNA   Regulate access to DNA   Have many modifications   Acetylation, methylation, …

  Sporadic proteins (Transcription Factors)   Mediate docking of transcription apparatus   Modify histones   Methylate DNA

Histones are an ancient family of proteins which serve as the scaffold for DNA

Histones

Four types of histones assemble in pairs to form a nucleosome

DNA is wrapped twice around each nucleosome

Histones and Modifications DNA contacts histones on their tails

Histone tails can be modified

Histones can stay loose or assemble tightly – this compacts the DNA

General Roles of Histone Modifications Gene$Regula*on$

Wade P A Hum. Mol. Genet. 2001.

DNA$Damage$

Moggs$and$Orphanides,$Toxicological$Sciences,$2004.$

Transcription Factors   General – help to set up transcription of many genes   Specific – draw in general factors or RNA Pol II to specific genes

TATA Binding Protein

General Roles of Histone Modifications Chroma*n$Condensa*on$

Kruhlak M J et al. J. Biol. Chem. 2001.

Spermatogenesis$

Specific$Histone$Modifica*ons$

•  Positions that are modified •  Modifying enzymes •  Functions of the modification

Lysine$Acetyla*on$

Bhaumik,$Smith,$and$Shila*fard,$2007.$

Roles of Acetylation" 4.#Highly$correlated$with$ac*ve$transcrip*on$$ #i.e.#enriched#at#TSS#of#ac1vely#transcribed#genes# H4Ac$

H3Ac$

H3$

RNAPII$

Expression:$P1...