humane genoom en onze genen PDF

Preview

Summary

erfelijkheidsleer, humane genoom en onze genen, inclusief schema's...

Description

Les 4

Het menselijk genoom en onze genen 1) Het menselijk genoom

Het genoom beschrijft de combinatie van alle erfelijke factoren, het legt het genotype voor alle eigenschappen vast. Het genoom van een organisme omvat één complete set van chromosomen. De celkern van een humane somatische cel bevat 23 paar chromosomen (diploïd genoom). Elk chromosoom is opgebouwd uit sterk opgewonden strengen DNA (= deoxyribonucleïnezuur). DNA is een nucleïnezuur, net als RNA. De naam nucleïnezuren is afgeleid van het feit dat de moleculen een zuur karakter hebben en in de kern (nucleus) zijn ontdekt. Later is pas duidelijk geworden dat sommige RNA en DNA moleculen ook buiten de kern kunnen voorkomen; voorbeelden zijn rRNA (ribosomaal RNA), tRNA (transfer RNA) en mRNA (messenger RNA) (zie verder in dit hoofdstuk). In les 6 zal mtDNA (mitochondriaal DNA) besproken worden: dit komt voor in de mitochondriën, die buiten de celkern liggen en die alleen via de moeder overerven. Nucleïnezuren zijn de grootste moleculen die aangetroffen worden in levende cellen. Het zijn complexe biochemische macromoleculen waarin een groot aantal bouwstenen, de nucleotiden, aan elkaar geschakeld zijn. Elk levend organisme gebruikt ditzelfde chemisch systeem om erfelijke informatie op te slaan, uit te drukken en over te dragen op de volgende generatie. Nucleïnezuren zijn dus universele moleculen.

2) DNA, drager van erfelijke informatie DNA is opgebouwd uit nucleïnezuren. Een nucleïnezuur is een polymeer van nucleotiden of met andere woorden een polynucleotide. Alle nucleotiden zijn opgebouwd uit drie onderling covalent gebonden moleculen: 

een stikstofhoudende base; 1



een pentose of een suiker;



een fosforzuurmolecule (PO43-).

Basen: De basen behoren tot twee groepen, de pyrimidinebasen en de purinebasen, respectievelijk afgeleid van pyrimidine (een zesring bestaande uit 4C-atomen (C=koolstof) en 2N-atomen (N=stikstof)) en purine (een gecondenseerde 5-en 6 ring, elk met twee N-atomen). Als pyrimidinebasen treffen we thymine (T), uracil (U) en cytosine (C) aan, als purinebasen adenine (A) en guanine (G).

2

3

Pentosen: deoxyribose en ribose Er komen slechts twee pentosen voor in de nucleotiden: deoxyribose (links op onderstaande figuur) en ribose (rechts op onderstaande figuur). DNA is opgebouwd op basis van deoxyribonucleotiden, RNA is opgebouwd op basis van ribonucleotiden.

Figuur:

afbeelding

van

een

deoxyribose (links) en een ribose (rechts)

Zowel DNA als RNA zijn opgebouwd uit slechts vier verschillende nucleotiden. DNA is opgebouwd uit de deoxyribonucleotiden die de basen A, C, G en T bevatten. RNA is opgebouwd uit de ribonucleotiden die de basen A, U, G en C bevatten. RNA en DNA verschillen dus in de aard van het pentose en één van de basen.

Binding tussen de bouwstenen Verschillende nucleotiden worden aan elkaar gebonden door waterafsplitsing tussen de OH (hydroxyl groep, bestaat uit zuurstof (O) en waterstof (H)) van een 3’C van een pentose en een OH-groep van de fosforzuurrest op een andere nucleotide. De ruggegraat van een nucleïnezuur bestaat aldus uit een afwisseling van een pentose en een fosforzuurmolecule, waarbij het pentose via het 5’ en 3’ C-atoom gebonden is aan twee fosforzuurresten. Het overblijvende H-atoom wordt in waterig milieu afgesplitst (waardoor we beter van een fosfaatgroep spreken). De twee uiteinden van een enkelstrengige DNA-streng zijn asymmetrisch, en worden aangeduid met 5’ en 3’. 4

Een RNA-molecule is een polymeer van 100 tot een paar honderdduizend nucleotiden, een DNA-molecule is een polymeer van 103 tot >108 nucleotiden. Verschillende moleculen onderscheiden zich van elkaar door het aantal nucleotiden, het aantal van elk nucleotide en de volgorde van de nucleotiden. Omdat de nucleotiden enkel verschillen in de gebonden basen, bepaalt de volgorde van de basen de specificiteit van het nucleïnezuur. Daarom worden de nucleotiden vaak enkel voorgesteld door de gebonden basen.

Het haploïde humane genoom (in de germinale/voortplantingscellen) bestaat uit 23 chromosomen, en telt ongeveer 3 miljard (3.10 9) basenparen (bp) of 6 miljard nucleotiden. De DNA segmenten die de genetische informatie dragen, worden genen genoemd. Het menselijke genoom is opgebouwd uit ongeveer 22.000 genen. De genen (= erfelijke factoren) zijn de eenheden van het erfelijke materiaal en kunnen specifieke eigenschappen van een individu bepalen (bijv.: haarkleur, kleur ogen,…). Niet alle elementen van een gen coderen voor een bepaalde eigenschap: we onderscheiden exonen (coderende stukken DNA) en intronen (niet-coderende stukken DNA). DNA-structuur Watson J. en Crick F. stelden in 1953 dat het DNA in de kern aanwezig is als een dubbele helix opgebouwd uit 2, in tegenoverstelde richting georiënteerde (= antiparallel) (3’ 5’ en 5’ 3’) polynucleotideketens die als een spiraal om elkaar heen gewonden 5

zijn. De lange polynucleotideketens ontstaan door polymerisatie van de nucleotiden via 3’-5’ fosfodiësterbindingen tussen aanpalende deoxyribose-eenheden. De ruggegraat van elke keten zit aan de buitenkant en wordt gevormd door de fosfaatgroepen en koolstof bevattende suikers. Beide spiralen worden samengehouden door de vorming van waterstofbruggen tussen de N-bevattende basen, die aan de binnenkant van de keten gelegen zijn, waarbij telkens een purinebase ten opzichte van een pyrimidine base gericht staat. Ten opzichte van A staat steeds T, tegenover een G steeds een C. A en T en G en C worden daarom complementaire basen genoemd. Tussen A en T vormen zich telkens twee H- bruggen, tussen G en C telkens drie H-bruggen. Wanneer dus de sequentie van de nucleotide-basen op de ene streng gekend is, kan automatisch

de

sequentie

van

de

andere

streng

worden

afgeleid.

Deze

basecomplementariteit is belangrijk voor de replicatie (S-fase van de celcyclus, synthese van 2de chromatide) en herstel van fouten (= mutaties).

De lengte van deze polynucleotideketens in het menselijk genoom varieert van ongeveer 50 miljoen baseparen (bp) voor het kleinste chromosoom (chromosoom 22) tot 250 miljoen bp voor het grootste chromosoom (chromosoom 1).

Structuur van een chromosoom In elke menselijke cel bevindt zich ca. 2 meter DNA. Dit vereist een zekere mate van compactie van het DNA. De helix, 2.2 tot 2.6nm breed, telt 10 baseparen per winding (360°) en vertoont een grote en kleinere groeve.

6

Een chromosoom is gecondenseerd chromatine. Een chromosoom is dus een bijzonder sterk opgewonden dubbelstrenginge DNA-molecule rond een eiwittencomplex. De eiwitten spelen een cruciale rol in het samenpakken van het DNA: de lengte van chromosoom 1 zonder eiwitten is ~15 cm en met eiwitten ~1.5 cm (1/10). We onderscheiden basische eiwitten of histonen en zure eiwitten (niet-histonen). Er zijn 4 soorten histonen, H2A, H2B, H3 en H4. Histonen zijn basische eiwitten. Twee kopijen van elk van deze 4 histonen vormen samen een octameer (octa= 8). Het DNA windt zich rond deze histon-octameren. Per octameer (eiwitkern) zijn er 2 DNA-windingen, of ~140bp. Tussen 2 opeenvolgende histon-DNA complexen is er een interval van ~2060bp. Een complex bestaande uit de histonkern, DNA rond histon en DNA-interval noemt men een nucleosoom. Een nucleosoom omvat dus ~200bp. De opeenvolging van de nucleosomen (=nucleosoomvezel) kan vergeleken worden met een parelsnoer. Deze nucleosoomvezel rolt zich verder op in een helixvormige structuur of chromatinevezel. Elke winding van de chromatinevezel telt hierbij ongeveer 6 nucleosomen. Hierdoor is er opniew een reductie tot 1/5 van de lengte. De chromatinevezel vormt verder lussen door zich vast te hechten (  om de 100 kb) (kb=kilobasen=1000bp) aan een centrale steiger of scaffold. Deze scaffold is opgebouwd uit zure niet-histon eiwitten (vb. topoisomerase II) die een affiniteit vertonen voor AT-rijke DNA sequenties. Tenslotte is er een verdere condensatie tot het metafasechromosoom. Bij deze maximale condensatie is de DNA streng gereduceerd naar ongeveer 1/50.000 van zijn oorspronkelijke lengte.

3) Het centrale dogma van de moleculaire biologie

DNA dirigeert de synthese en sequentie van RNA, RNA dirigeert de synthese en sequentie van de polypeptiden en van specifieke eiwitten betrokken in de synthese van DNA en RNA. Deze flow van informatie wordt het ‘centrale dogma’ van de moleculaire biologie genoemd.

7

DNA omvat de genetische informatie en wordt gebundeld in de chromosomen gelegen in de celkern (en in de mitochondriën). De eiwitsynthese (aan de hand van de informatie gecodeerd in het DNA) gebeurt in het cytoplasma. Het DNA is gescheiden van het cytoplasma door de kernmembraan. Deze compartimentalisatie onderscheidt de mens, als eukaryoot, van de prokaryoot (vb. E. Coli bacterie) waarbij het DNA niet in een celkern gelegen is. Omwille van deze compartimentalisatie van de eukaryote cel gebeurt de transfer van informatie van de celkern naar het cytoplasma via een complex mechanisme. De moleculaire link tussen deze twee types van informatie (DNA code van de genen enerzijds en de aminozuursequentie van de eiwitten anderzijds) is het RNA of ribonucleïnezuur. De chemische structuur van RNA is vergelijkbaar met die van DNA behalve dat elke nucleotide in RNA een ribose-suiker (in plaats van deoxyribose) heeft en dat de pyrimidine base Thymine vervangen wordt door Uracil (U). Een bijkomend verschil tussen RNA en DNA is dat RNA in de meeste organismen voorkomt als een enkelstrengige molecule daar waar DNA dubbelstrengig is. De synthese van RNA uitgaande van de DNA template noemt men de transcriptie. Het RNA die de erfelijke informatie overbrengt van de celkern naar het cytoplasma wordt het messenger RNA (mRNA) genoemd en vormt dus de ‘schakel’ tussen het DNA in de kern en de proteïne of eiwitsynthese. Het mRNA is een complementaire kopie van het coderende DNA. De RNA sequentie van dit mRNA wordt vervolgens vertaald naar de aminozuur (AZ) sequentie van het betrokken eiwit. Dit proces is de translatie. De translatie heeft plaats op de ribosomen, cytoplasmatische organellen met bindingsplaatsen voor al de interagerende moleculen. De ribosomen zijn opgebouwd uit verschillende structuureiwitten in associatie met een speciaal type RNA, het ribosomaal RNA (rRNA). Bij de translatie is nog een derde type van RNA betrokken, nl. het transfer RNA (tRNA), die de moleculaire link vormt tussen de base sequentie van het mRNA en de AZ sequentie van het eiwit.

8

3.A. DNA replicatie Wanneer cellen delen krijgen beide dochtercellen een foutloze kopie (op een paar mutaties na) van het DNA van de moedercel. DNA replicatie is dus het proces waarin DNA verdubbeld wordt. Tijdens de S-fase van iedere celcyclus wordt een exacte kopij gemaakt van het DNA dat in ieder chromosoom aanwezig is. Het complementair zijn van de ketens, één van de belangrijkste implicaties van het dubbele helix model, is essentieel voor de DNA replicatie. De DNA replicatie is semi-conservatief, dit wil zeggen dat van elke oude keten een nieuwe wordt gemaakt die complementair is aan de oude. Replicatie begint met het uiteenwijken/despiraliseren van beide strengen ter hoogte van welbepaalde sequenties (origin of replication = ORI). Het DNA wordt er door DNAhelicase ontwonden. Het helicase zorgt voor het doorbreken van waterstofbruggen en hydrofobe interacties. Deze ORI’s hebben de vorm van een stemvork met de dubbele helix als steel en de uit elkaar geweken ketens als tanden. Deze ketens zijn de templates (matrijzen) voor de synthese van de dochterketens. Vanuit ieder initiatiepunt beweegt zich een vork naar links en naar rechts. Zodra 2 aangrenzende vorken elkaar ontmoeten, fuseren de nieuw gevormde DNA moleculen. Op de 'origin of replication' (ORI) hecht zich een door het enzym primase gemaakte RNA-primer. Deze bestaat uit een 30-tal RNA-nucleotiden die het mogelijk maakt dat DNA-polymerase deoxyribonucleotiden polymeriseert. Dit is het beginpunt van de DNAsynthese. Aan de RNA-primer hecht het DNA-polymerase een aan de oude DNA-streng complementair nucleotide. Er wordt verder bij elke stap een volgende nucleotide hieraan vastgemaakt tot de hele streng is afgelezen. DNA polymerasen zorgen voor de aanmaak van de nieuwe streng door het tot stand brengen van de 3’-5’ fosfodiësterbindingen. Bijgevolg verloopt de DNA replicatie op beide strengen op verschillende wijzen:

9



De keten waar de replicatie continu verloopt, is de leading strand: het DNA polymerase leest de keten af in de richting van 3’ → '5 om vervolgens een streng te maken die van 5' → 3' loopt.



Op de andere, complementaire keten kan de replicatie niet continu verlopen en wordt het DNA met kleine stukjes of Okazaki fragmenten gesynthetiseerd. Deze keten noemt men de lagging strand. De streng in 5' → 3' richting wordt daarom in kleine stukjes ook in de 3' → 5' richting afgelezen, omdat telkens maar een klein stukje van de dubbele DNA-streng wordt “open geritst”. De stukjes zijn ongeveer 100 tot 200 nucleotiden lang. Na ongeveer 100-200 nucleotiden hecht zich opnieuw een RNA-primer aan de oude DNA-streng en wordt een nieuw stukje van de keten gesynthetiseerd enz. De primer en het daarbij behorende stukje DNA wordt een Okazaki-fragment genoemd. De Okazaki

fragmenten worden

vervolgens door een DNA ligase verbonden.

10

11

3.B. Transcriptie Regio’s in de genen die een belangrijke rol spelen bij transcriptie Een gen is een sequentie van chromosomaal DNA dat nodig is voor de aanmaak van een functioneel product, namelijk een eiwit (polypeptide) of een functionele RNA molecule. Het functioneel product kan zijn; een structureel eiwit van de extracellulaire matrix, een membraaneiwit, een transportmolecule, een enzym of transcriptiefactoren. Het DNA is dus belangrijk voor de regulatie van de embryogenese, de groei en ontwikkeling, de stofwisseling en de reproductie. De coderende sequentie van een gen wordt onderbroken door één of meerdere nietcoderende regio’s of intronen. Deze intronen worden initieel in de celkern overgeschreven naar het RNA, maar zijn niet meer aanwezig in het matuur (‘rijp’) mRNA in het cytoplasma. De informatie van de intronen is dan ook niet aanwezig in het eindproduct (eiwit). De AZ sequentie van de eiwitten wordt volledig gecodeerd door de coderende sequenties of de exonen. Slechts enkele genen in het menselijk genoom hebben geen intronen. Vaak is de cumulatieve lengte van de intronen veel groter dan de totale lengte van de exonen van een gen. Een gen omvat naast de exonen en intronen nog aanpalende nucleotide sequenties die belangrijk zijn voor de juiste expressie van een gen (productie van een normale mRNA molecule, juiste hoeveelheid, juiste plaats en juiste tijdstip tijdens de ontwikkeling of celcyclus). Deze nucleotide sequenties vormen de start en stop-signalen voor de synthese van mRNA. Aan het 5’ einde van het gen ligt de promoter: een regio die specifieke DNA sequenties bevat verantwoordelijk voor regulatie/ initiatie van transcriptie: de TATA box (TATAAA) op positie –25 à 30 (dit wil zeggen 25 bp van het beginpunt van transcriptie); de CCAAT box op positie –80. Niet alle genpromotoren bevatten deze 2 specifieke promoter proximale elementen: de TATA en CCAAT box zijn kenmerkend voor weefselspecifieke genen. De promoter van de ‘housekeeping’ genen (expressie in nagenoeg alle weefsels) hebben een GC box (GGGCGG) op positie –100 à 150. Naast de sequenties die deel uitmaken van de promoter zelf, zijn er nog andere sequenties, meer op afstand, gelegen die de efficiëntie van de transcriptie beïnvloeden. De enhancers zijn de best gekarakteriseerde van deze activerende elementen. 12

Enhancers stimuleren de transcriptie en liggen vaak verschillende kb verwijderd van het gen. In tegenstelling tot de promoter, kunnen enhancers zowel 5’ als 3’ van de startplaats gelegen zijn. Al deze genoemde specifieke DNA sequenties zijn cis-acting elementen (liggen op hetzelfde chromosoom). De cis-acting elementen zijn belangrijk voor de regulatie en/of initiatie van de transcriptie.

http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Gene_Expression_II5ARNAP_II_Promoter.htm

Transcriptie De synthese van RNA uitgaande van de DNA template noemt men de transcriptie. Hierbij zijn transcriptiefactoren betrokken: dit zijn eiwitten die interageren met deze specifieke regulatorische sequenties. De transcriptiefactoren zijn trans-acting elementen (gelegen op een ander chromosoom dan het gen dat ze reguleren). Transcriptie start met de binding van RNA-polymerase II ter hoogte van een specifieke regio, de promoter, die 15 tot 300 bp voor het gen gelegen is. De binding van RNApolymerase II met de promoter kan bij eukaryoten slechts plaatsvinden nadat bepaalde proteïnen, zgn. transcriptiefactoren, zich vastgehecht hebben op de promoter en het RNA-polymerase. De promoter bevat meestal een herhaling van TA: de TATA-box. De ‘start site’ is upstream gelegen van de eerste coderende sequentie. Dit punt stemt overeen met het 5’ einde van het finaal RNA product. De synthese van het primair RNA transcript gebeurt in 5’  3’ richting, de enkelvoudige DNA streng wordt daarentegen afgelezen in 3’  5’ richting. Omdat de polariteit en 13

basesequentie van de RNA streng overeenstemt met de niet overgeschreven 5’  3’ DNA streng, wordt deze niet overgeschreven DNA streng de ‘coderende’ of ‘sense’ streng genoemd. De 3’  5’ overgeschreven DNA streng wordt bijgevolg de ‘niet coderende’ of ‘anti-sense’ streng genoemd. Omdat tijdens translatie (synthese van eiwitten) de RNA-molecule bekomen na splicing wordt gebruikt, wordt deze molecule mRNA genoemd. De RNA-molecule bekomen na transcriptie, die zowel de intronen als exonen bevat, wordt het pre-mRNA genoemd.

Posttranscriptionele modificaties van mRNA Splicing, capping en polyadenylatie zijn 3 stappen die noodzakelijk zijn om het primaire RNA transcript om te vormen naar matuur mRNA. Deze stappen gebeuren niet helemaal sequentieel maar gaan continu door.

RNA splicing: Hierbij worden de intronen uit het primaire RNA transcript verwijderd (door enzymen die men endonucleasen noemt) en de exonen aan elkaar gekoppeld (door enzymen die men ligasen noemt) met vorming van het mature RNA. Het betreft dus een serie van

14

reacties waarbij intronische RNA segmenten worden verwijderd terwijl de exonische RNA fragmenten aan elkaar geligeerd worden. RNA splicing vereist de herkenning van de nucleotide sequenties aan de uiteinden van de overgeschreven exonen en intronen. Deze nucleotide sequenties zijn sterk geconserveerd: de grote meerderheid van de intronen start met GT (wordt GU in intronisch RNA) en eindigt op AG. Naast de RNA splicing ondergaan de transcripten modificaties, namelijk: 5’capping: Kort na de initiatie van de synthese van primaire RNA transcripten, gebeurt capping. Dit is het blokkeren van het 5‘ uiteinde (kop) van het primaire RNA transcript door toevoegen van 7-methylguanosine (guanine variant) door middel van een speciale phosphodiëster aan de eerste nucleotide. 3’polyadenylatie: Transcriptie stopt nadat het RNA polymerase een specifieke transcriptie terminatie site heeft herkend. Op een specifieke plaats in de poly-A staart gebeurt dan een “cleavage” (“splijting”) door het endonuclease. Na de cleavage gebeurt een polyadenylatie aan het 3’ uiteinde (toevoegen van een lange sequentie van adenines). De 5’capping en 3’polyadenylatie beschermen de uiteinden van de RNA transcripten tegen cellulaire exonucleases (afbraak enzymen) en zorgen voor een correcte functionering van de RNA transcripten.

15

Hieronder kan je nog enkele figuren vinden om deze stappen verder te verduidelijken.

(Bron: Strachan and Read, Human Molecular Genetics 4th edition)

16

= transcriptie factor

17