Identificación de Mucopolisacáridos ácidos PDF

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Tecnicas como PAS y alcian blue...

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Identificación de Mucopolisacáridos ácidos Para la fijación, al igual que para PAS, es preferible fijadores a base de alcohol como la acetona, Bouin alcohólico, formol alcohol. Pero está la desventaja de que se va a retraer el tejido. El objetivo será identificar aquellos MPS que se encuentran unidos a macromoléculas como lo son las proteínas. Los MPS se podrán identificar por los carbohidratos que conforman su estructura, y se suelen encontrar en secreciones y tejido glandular. • Polisacáridos. Compuestos enteramente por Hidratos de Carbono, reconocido por reactivo de Schiff o Carmín de Best. Ej. glicógeno • Proteoglicanos. Largas cadenas de polisacáridos que tienen unidades de disacáridos repetitivas unidas a una proteína central pequeña (Core protein). • Glicoproteínas. Proteínas constituidas por oligosacáridos unidos por enlaces covalentes. Ej. inmunoglobulinas (difícil de ver en HQ), productos de secreción, glicocálix, amiloide, etc. En los mucopolisacáridos encontramos condroitín sulfato B (fibrinógeno, fibrina, en la matriz cartilaginosa), Heparina (todo el organismo, acción anticoagulante en células cebadas), keratosulfato (arterias coronarias, cordón umbilical y hueso adulto), ácido hialurónico (liquido sinovial, humor vítreo, mesoteliomas, piel, riñón, cartílago, coronarias, aorta. Es importante para el ensamblaje de otros GAG), ácido condroitín sulfato A y C (cordón umbilical, aorta, coronarias, arterias cerebrales, cartílago, piel y huesos). El heparán sulfato posee menos grupo sulfato en comparación a la Heparina, se ubica en membrana basales y componentes de la superficie celular. Mientras que la heparina se encuentra en los gránulos intracelulares de los mastocitos que recubren arterias de pulmones, hígado y piel. El más abundante de los condroitín sulfato es el condroitín 4-6 sulfato, el cual se encuentra en los condrosarcomas, cartílago, hueso y válvulas cardiacas. Para poder identificarlo, se emplea el método de alcian blue al pH 2,5 y 1,0, también se usa el fierro coloidal, pero éste es más difícil de emplear. El alcian blue es un colorante básico derivado de la talocianina cúprica, sus grupos isotiourónicos son atraídos por los MPS ácidos, es irritante, por lo que su manipulación debe ser cuidadosa y bajo campana, se almacena a baja temperatura y en un área ventilada, se recomienda mantener bien tapado. El alcian blue es utilizado en solución acuosa (ya sea comprado como tal, o en polvo), colorea a grupos ácidos y dicha unión fija al cromóforo llamado ptalocianina. Lo importante de los pH, es que si es 2.5 se unirá a todos los grupos ácidos del tejido (grupo carboxilo y éster sulfato), pero si se trabaja a pH 1, se encontrará solo a los grupos sulfatados teñidos, y es debido a que en pH 1 los grupos carboxilos no se encuentran ionizados, por lo que no atraerán al colorante.

Ejemplo de cordón umbilical en gelatina de Warthon, la cual fue teñida con alcian blue y es rica en ácido hialurónico. El alcian blue debería teñir los núcleos, pero no sucede esto y se usa colorante de contraste, se postula que la molécula es demasiado grande para traspasar las membranas y por eso es incapaz de realizar tinción nuclear. Los grupos tetrametil-isotiurónicos unidos al anillo de Ptalocianina producen una molécula muy grande lo que impide que quede a una distancia ideal para que se genere la fuerza electrostática ya sea con el grupo fosfato, como así mismo se generen interacciones de tipos fuerzas de Van der Walls entre los anillos aromáticas del colorante y las bases. Una ventaja, es que no es removido por agua, alcohol o soluciones ácidas. Ej. PAS/AB Al momento de elegir un colorante de contraste, no se recomienda la hematoxilina porque la gama de colores es muy similar, por lo que sería difícil identificar sustancias y secreciones. Lo que sí se recomienda, es emplear de eosina, safranina, rojo neutro, Van Gieson y PAS. La safranina es un colorante catiónico, el cual al ser usado con alcian blue tiñe por diferencia de pH (normalmente no tiñe ARN ni núcleo, pero en soluciones ácidas si sucede). Protocolo Alcian Blue pH 2.5     

Desparafinar y llevar cortes hasta agua destilada Teñir en solución de alcian blue durante 20 a 30 minutos Lavar en agua corriente por 5 minutos, seguida de agua destilada Tinción de contraste (rojo neutro, eosina, etc.) DAM (Deshidratar, aclarar y montar)

Protocolo Alcian Blue pH 1.0    

Desparafinar y llevar los cortes hasta el agua destilada Teñir en solución de alcian blue durante 30 minutos. Secar los cortes con papel filtro sin lavar Deshidratar en 2 cambios de alcohol absoluto y en otro cambio de alcohol-xilol 1:1, aclarar en xilol y montar en resina sintética.

Se emplea 1gr de Alcian Blue 8G en 100ml de Ácido acético 3% Para hacer control se recomiendan tejidos como el intestino delgado, apéndice y colon. Ahora, si se quiere emplear un control negativo, la hialuronidasa sirve para tratamiento enzimático. Hay bloqueos específicos como la esterificación a COOH (reversible) y sulfonación para SO3 (según la profe se llama desulfonación).

En la reacción superior, se ve el proceso de esterificación. Se emplea un ácido carboxilo, metanol y HCL a 60°C para eliminar los grupos carboxilos de la muestra, y como ya se mencionó, como es reversible, se emplea hidroxilo de potasio con alcohol 70°C (saponificación). En la reacción inferior, se agrega metanol, un ácido sulfónico, y HCL a 60°C para producir la sulfonación.

Tinción Alcian Blue/PAS PAS se encargará de teñir mucosustancias neutras, mientras que el alcian blue las ácidas. Primero se emplea el al cian blue y posterior a esto se utiliza el PAS. Por consecuencia de la superposición glandular y de colorantes, se verán cambios en la coloración, como el alcian blue visualizándose de un azul mucho más fuerte de lo usual. El método es el siguiente:        

Desparafinar e hidratar hasta agua destilada. Teñir en solución de Alcian Blue pH 2.5 (no es recomendable pH 1 ya que se quiere hacer diferencia de MPS) Lavar en agua destilada y oxidar en Ácido Peryódico durante 15 minutos. Lavado en agua corriente durante 5 minutos, seguido de lavado en agua destilada. Colocar en reactivo de Schiff durante 20 minutos. Lavar en tres baños de agua sulfurosa, 5 minutos por baño. Lavar en agua corriente. DAM

Método del Hierro Coloidal Ciertas mucinas del tejido conjuntivo son capaces de absorber el hidróxido férrico coloidal. Se emplea en el estudio de neoplasias epiteliales renales, así como granulomas de la piel. El hierro lo encontramos en los tejidos como sales ferrosas y férricas. Se emplea una solución de cloruro de fierro al 29% El cloruro de fierro se pone a hervir en agua y se obtiene un coloide de hidróxido de fierro, se pone la placa en dicha solución hervida y se obtiene la atracción de los grupos carboxilos al fierro, dando como resultado el ferrocianuro férrico llamado azul de Prusia (recomendable para hemosiderina).

Este método no suele emplearse por la complejidad que posee. Se deben emplear ácido acético glacial al 3%, preparar una solución madre de fierro coloidal (cloruro hervido), una solución de trabajo de fierro coloidal, ácido acético al 1% y una solución de ferrocianuro de potasio. Se basa en la propiedad que tiene el Ferrocianuro de Potasio para transformarse, en presencia de hierro férrico Fe +++, en Ferrocianuro Férrico, de color azul de Prusia por acción del HCl, que actúa como desencadenante de la reacción.

HE

Alcian Blue

PAS

Método de Azur de Toluidina Con este método, ocurre una metacromasia, la cual, se produce por presencia de abundantes ésteres sulfúricos en polisacáridos del tejido. A pH menor a 3 reacciona sólo mucosustancias sulfatadas, pero varias sialomucinas (intestino delgado) presentan metacromasia a pH superior a 3.

Métodos de bloqueo Sirven para bloquear grupos carboxílicos de la mucina para lograr un estudio diferencial   

Metilación Violenta: esterificación con HCL a 60°C reversible mediante saponificación. Metilación Moderada: alcohol metílico durante 4-6hrs a 37°C. Acetilar: introducir grupo acetilo en un compuesto orgánico, el cual bloquea todos los grupos alcohólicos.

Patologías Asociadas a Carbohidratos     

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Inflamaciones catarrales Neoplasias como adenocarcinomas, mixomas, tumores de mama, etc. Degeneración de la pared arterial Mucopolisacaridosis: ausencia o mal funcionamiento de enzimas necesarias para el procesamiento de GAG Enfermedades metabólicas como enfermedad de von Gierke (en hígado también llamada glucogenosis tipo I), enfermedad de Pompe (en neurona, hígado, miocitos. También se le conoce como glucogenosis tipo II), y enfermedad de Cori-Forbes (en neuronas, miocardio y musculo liso. También llamada glucogenosis III) Sarcoma de Ewing: neoplasias derivada de tejido embrionario denominado "cresta neural”, o derivada de células madre mesenquimales que tienen la capacidad de transformarse en distintos tipos de tejido.

Adenocarcinoma Esófago de Barret. Se mucinoso Grupo heterogéneo de neoplasias observa metaplasiaElrodeado formadas por células redondas, del estómago. mucus por epitelio escamoso. pequeñas, de localizaciones dentro de las células en anillo Mucinas neutras color1250x anatómicas diversas, afectando de sello. Azulde Alcian. rosadas-magenta en células preferentemente al hueso. columnares

Es 5pe eosinofilo en H-E (casi transparente), pero tiene birrefringencia verde con luz polarizada. Se deposita bajo en endotelio de pequeños vasos y arterias, y capilares bajo la membrana basal, cerca del tejido conjuntivo. Efecto en los organos: 

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Riñón: Nefromegalia y punteado blanquecino. El corpúsculo renal presenta depósito en el mesangio, membrana, distorsión de ovillo vascular, y sustitución de glomérulo por amiloide. Bazo: Esplenomegalia, deposito en forma de gránulos. El tejido intersticial peritubular, arteriolas. Amiloide en corpúsculos esplénicos y paredes sinusoidales. Hígado: Hepatomegalia con aclarado. Amiloide en espacio perisinusoidal, atrofia por presión de hepatocitos, desaparición de hepatocitos. Compromiso por crecimiento del depósito. Otros: corazón, páncreas, tracto gastrointestinal, SN, tiroides, nódulos linfáticos.

Si tejido fresco se sumerge en una solución de ácido sulfúrico al 5%, el color vira a un tono verdeazulado con que se destaca mejor la zona comprometida, en lugol se observa punteado café caoba. Normalmente se fija con formalina al 10%, ya que el formaldehido actuaría sobre el grupo amino de la proteína permitiendo una buena reacción para el PAS y Rojo Congo (bien fijado y en corto tiempo). Identificación del amiloide   

Método de Higman Método de Benhold: tinción con rojo congo. Fluorescencia.

El amiloide está compuesto por cadenas, dispuestas de manera ordenada unas al lado de otros. Las moléculas del rojo congo son capaces de intercalarse dentro de estas cadenas. Método de Benhold:    

20 minutos en solución de Rojo Congo Diferenciar en una solución alcalina como carbonato de litio. Contraste con hematoxilina de Harris Deshidratación y montaje

Es importante fijarse en el grosor del corte, se recomienda 8 micras para ayudar a identificar la sustancia. En caso de hacer la técnica en microondas se debe realizar en 2 minutos a potencia media, ya que a menor potencia la tinción es muy débil y si se sube la temperatura se puede quemar o desprender.

Dicroísmo es la propiedad de ciertos cristales birrefringentes de absorber en una determinada dirección, uno de los rayos polarizados, de manera que el cristal, en esa dirección, parece de otro color. Dicha birrefrigencia es una característica óptica que consiste en la separación de un rayo luminoso

Amiloidosis HE

Amiloidosis Rojo Congo

Glomérulo Normal HE

en dos, dependiendo del ángulo de incidencia, ocurre en algunas estructuras biológicas semejantes: Ambos rayos separados

se propagan con velocidad y longitudes de onda diferentes. (A Rojo Congo, B luz polarizada color verde manzana)

A

B

Si antes de realizar la tinción de Rojo de Congo el tejido es tratado con una solución de permanganato de potasio, un grupo de sustancias amiloideas no se tiñe con Rojo de Congo y no muestra dicroísmo: es el amiloide sensible al permanganato de potasio, que corresponde generalmente a las formas AA (asociada al amiloide), sintetizada en el hígado y encontrada en la amiloidosis secundaria. Método de Higman: Cristal Violeta     

Corte en parafina Tinción metacromática por mucopolisacáridos Usa el colorante de Cristal Violeta No debe pasar por alcoholes Debe realizarse en pH ácido.

Método de Tioflavina T     

Colorante básico que forma puentes de hidrógeno entre grupos hidroxilos de las células. Se une a grupos cationicos del tejido. Técnica fácil de aplicar. Muy sensible. Sólo es visible con microscopio de fluorescencia y posee un valor elevado....