Il clonaggio posizionale, la genomica funzionale PDF

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appunti sui meccanisimi di clonaggio posizionale e sulla genomica funzionale ...

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! IDENTIFICAZIONE DI GENI MALATTIA: IL CLONAGGIO POSIZIONALE! ! Gli studi di associazione gene-malattia possono essere fatti per avere una diagnosi di malattia indiretta:! ! I marcatori polimorfici hanno consentito l’identificazione di geni malattia quando non era stato ancora sequenziato il genoma umano e non si conoscevano i geni coinvolti in malattie di cui era nota la manifestazione. ! ! Questo metodo è usato per identificare l’associazione tra alleli polimorfici e lo sviluppo di una malattia in famiglie con elevata suscettibilità a malattie complesse. ! ! • Il clonaggio posizionale e il chromosome walking hanno consentito l’identificazione del gene che codifica per la proteina CFTR, situato sul cromosoma 7 e la cui mutazione causa la fibrosi cistica, ma anche del gene coinvolto nella Corea di Huntington.! ! Il clonaggio posizionale consiste nell’identificazione del gene coinvolto nella malattia sfruttando le librerie genomiche: a partire dal tipo di trasmissione e dall’albero genealogico vogliamo sapere qual è il gene coinvolto nella malattia e dove si trova, per poterlo poi sequenziare, studiare e isolare.! ! ! • Partendo da un marcatore, si effettua uno screen in una libreria genomica per trovare uno o più cloni che corrispondono a vettori che contengono parti del DNA vicini al marcatore, se il marcatore è vicino al gene malattia si avrà nei cloni anche la sequenza del gene malattia.! ! • Quindi l’albero genealogico dice se c’è associazione con marcatori, uso i marcatori per selezionare dei cloni di una libreria genomica che possano includere frammenti vicini al marcatore e al gene d’interesse .! ! Mediante sequenziamento dei cloni, si trovano sequenze di geni candidati che, una volta sequenziati possono essere espressi in vettori di espressione e in una cellula mutante, consentendo l’osservazione delle sequenze in grado di ripristinare il fenotipo selvatico e complementare la sequenza persa in quella cellula.! ! 1° step: MAPPA GENETICA DI ASSOCIAZIONE.! Mappatura mediante uso di polimorfismi strettamente associati al gene malattia e di cui conosciamo la posizione sul genoma.! ! 2° step: MAPPATURA FISICA DELLA REGIONE COINVOLTA! Possiamo clonare questo gene se un marcatore cromosomico mappa in prossimità di esso.! ! CHROMOSOME WALKING ! Partendo da una sequenza di un marcatore polimorfico (RFLP, STR) si può costruire una sonda complementare alla zona dove è presente il marcatore. ! ! Con la sonda si fa uno screening di una libreria cromosomica (quindi tutti i cloni provenienti dal cromosoma in esame) per trovare i cloni che contengono la sequenza complementare al marcatore associato al gene d’interesse.! ! I cloni possono contenere solo la sequenza del marcatore o essere più lunghi e contenere altre

sequenze, per cui bisogna spostarsi su di essi per l’analisi e per trovare il gene di interesse.! ! Ad esempio la sequenza arancione viene usata per disegnare una sonda complementare che consente la rilevazione di un altro clone (clone B) contenente sia un frammento arancione che un’altra sequenza (quella rosa). Il procedimento viene ripetuto finché non si trova il gene d’interesse.! ! ! Quindi si usa un frammento per disegnare una sonda con la quale si fa uno screen della library per trovare dei cloni che vengono sequenziati e usati per costruire un’altra sonda e così via. ! ! ! ! ! In questo modo si ricostituisce l’intera sequenza che circonda il marcatore molecolare di partenza.! ! Oggi, nota l’associazione tra gene malattia e marcatore polimorfico e nota la posizione del marcatore, si analizza la sequenza di DNA presente su quel tratto di cromosoma e si verifica in banca dati quali geni si trovano in quella zona.! ! 3° step: IDENTIFICAZIONE DEL GENE MALATTIA TRA I GENI CANDIDATI.! Avviene mediante:! - analisi delle mutazioni presenti nello stesso gene di diversi pazienti affetti dalla! patologia; - complementazione funzionale, ovvero il ripristino del fenotipo normale in cellule! mutate; - produzione di un modello animale per la malattia; - identificazione della funzione svolta dal gene candidato.! COMPLEMENTAZIONE FUNZIONALE: selezione di cloni in cui il cDNA introdotto è in grado di complementare la mutazione e ripristinare un fenotipo wild type nella cellula mutata.Poi il cDNA viene isolato, sequenziato e si analizza il prodotto genico; infine con esperimenti di guadagno o perdita di funzione si conferma il ruolo funzionale del gene.! CLONAGGIO POSIZIONALE DEL GENE DELLA FIBROSI CISTICA! ! Con analisi di linkage si è trovata un’associazione con il cromosoma 7, di cui è stata isolata una regione contenente marcatori associati con il gene malattia. I marcatori sono stati analizzati e tra questi! sono stati scelti quelli più associati. Partendo dal marcatore in rosso sono stati. fatti esperimenti di screening di library con le tecniche del chromosome walking e chromosome jumping.! ! Le regioni intorno al marcatore sono state sequenziate e l’analisi ha mostrato la presenza di quattro geni candidati; dopo studi aggiuntivi di questi geni, fatti su pazienti con fibrosi cistica, si è osservata la! mancanza comune di una tripletta, quindi di un amminoacido responsabile della mutazione del prodotto genico.! ! ! LA GENOMICA FUNZIONALE ! ! La genomica funzionale ! ! Comprende tutte quelle tecniche che consentono la definizione dei geni, dei loro prodotti e la comprensione della loro funzione.! ! Ci sono due approcci:! ! - guadagno di funzione : ! i i di i di d i di d l d i

cellule; vengono utilizzati animali transgenici! ! - perdita di funzione, ! con eliminazione dell’espressione genica a livello di dna, RNA, proteine. Es. knock-out (topi). ! ! ! Studio della funzione di un gene mediante guadagno di funzione: ! ! • Aggiunta di una copia di un gene esogeno:! l’espressione del transgene può determinare una sovra- espressione (uso il cDNA in un vettore di espressione e posso porlo sotto il controllo di un promotore costitutivo, cioè sempre attivo come quelli virali, o promotore tessuto-specifico, cioè che si esprime solo in determinati tessuti, o promotori inducibili, cioè attivabili in uno specifico luogo o momento).! ! • Il vantaggio dell’approccio è la possibilità di ottenere un prodotto genico espresso in quantità e tempi definiti dall’operatore. Si può anche esprimere un prodotto mutato, ad esempio per studiare la variazione dell’effetto funzionale di una mutazione a seconda del tipo cellulare o dell’individuo in cui viene espressa.! ! ! • Studio della funzione di un gene mediante perdita di funzione: ! ! È un approccio informativo in quanto consente l’identificazione della funzione del gene a seconda del fenotipo che si ottiene a seguito dell’inattivazione. ! ! L’inattivazione a livello del DNA può verificarsi:! - tramite eliminazione del frame del gene, per cui non c’è trascritto funzionale! - tramite mutazione del gene (cambiare un dominio, rimuoverne una parte, fare un editing).! ! Inattivazione a livello del DNA: L’inattivazione del gene o la sostituzione di una sua parte a livello del DNA avviene con metodi basati sulla ricombinazione omologa. ! ! Si può usare un vettore con sequenze omologhe al DNA da eliminare, ma che ha anche una sequenza eterologa, ovvero un marcatore di selezione che ne blocca l’espressione (knock out), o una parte diversa dello stesso gene, ad esempio esone che codifica per amminoacidi presenti in un dominio funzionale, che può essere modificata introducendo una mutazione (knock in).! ! !

Animali transgenici: • Sono animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, per inserzione, eliminazione sostituzione del gene.! ! • Un animale knock-out è un animale geneticamente modificato, in cui è soppressa l’espressione di un determinato gene (solitamente per inserzione di una sequenza esogena, es. marcatore selezionabile)! ! • Un animale knock-in è un animale geneticamente modificato, in cui una parte del genoma viene sostituita con un’altra.!

Come si ottengono dei topi transgenici?! ! • ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali :! è fatta in vitro, poi la cellula transgenica è inserita nella blastocisti di una femmina gravida. ! Si forma un animale chimera di cui viene selezionata la progenie transgenica.! ! ! • microiniezione dell’uovo fecondato ! ! I topi si accoppiano, le uova fecondate sono prelevate dagli ovidotti della femmina,! in uno dei pronuclei è iniettato dna esogeno, gli embrioni sono impiantati in una femmina pseudogravida.! ! La prole è sottoposta a test per valutare la presenza del transgene così introdotto, i topi che contengono il gene sono fatti incrociare per produrre ceppi di topi omozigoti per il gene esogeno.! ! ! Esistono dei modelli murini transgenici per diverse patologie umane: ! ! ! GENE EDITING: LA TECNOLOGIA CRISPR/CAS Le sequenze CRISP sono state osservate nel genoma di diversi batteri, di cui costituiscono una sorta di “sistema immunitario adattivo”! ! Quando il batterio viene infettato da un virus può integrare alcune regioni del genoma virale nel proprio DNA. ! ! Si forma così un archivio di sequenze CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) utile per combattere infezioni future. ! ! In caso di successive infezioni da parte dello stesso virus, le sequenze CRISPR sono trascritte in corti RNA guida (con sequenza complementare al genoma virale), ai quali si abbina l’endonucleasi Cas9 (stadio 2 in figura).! ! Appaiandosi alla sequenza complementare sul DNA virale, l’RNA guida Cas9 sul bersaglio: il DNA virale viene digerito e l’infezione arginata.! ! Questo sistema può essere sfruttato per creare RNA-guida in grado di appaiarsi ad una specifica sequenza genica.! ! Si costruisce un RNA-guida fondendo un RNA di origine batterica (crRNA transattivante o tracrRNA) e un RNA complementare (crRNA) alla sequenza che si vuole modificare. ! ! Una volta espresso nella cellula, l’RNA guida si accoppia a Cas9 e lo guida sulla sequenza bersaglio! Se nella cellula è introdotta la sequenza corretta del gene che si vuole modificare, la ricombinazione omologa prenderà questa sequenza come stampo e andrà a correggere in modo definitivo il gene mutato.! ! ! CAS9 è una endonucleasi che taglia il dna nel sito riconosciuto dall’una-guida e attiva i processi di riparazione del dna e per ricombinazione omologa.!

Applicazioni nella ricerca: • creazione di librerie di rna-guida per modificare contemporaneamente più geni! • Mutare geni solo su tessuti specifici! ! In medicina: -per malattie genetiche : correggere mutazioni nelle cellule staminali in vitro (es. mutazione alla base di anemia falciforme/emofilia)! ! -per malattie infettive (hiv)! Selezionare le mutazioni che rendono le cellule immuni all’infezione ! Modificare il genoma del virus per impedirne la replicazione ! ! Per la terapia dei tumori: -immunoterapia antitumorale (es. inattivazione linfociti t della proteina PD-1, #che viene utilizzato dalle cellule tumorali per sfuggire alla sorveglianza del sistema immunitario).! ! ! ! INATTIVAZIONE DEL GENE A LIVELLO DELL’RNA.! ! • Un semplice approccio è l’induzione della degradazione dell’mRNA del gene specifico da silenziare. ! • Questa tecnica si chiama RNA interference e sfrutta le molecole di RNA a doppio filamento in cui uno dei due filamenti è complementare all’mRNA target.! ! • La molecola di siRNA (small interfering RNA) viene inserita all’interno delle cellule, riconosciuta dal complesso proteico RISC, quindi il filamento che è termodinamicamente più stabile e complementare alla sequenza target viene mantenuto, l’mRNA viene tagliato e degradato.! ! • Il siRNA ci permette di ottenere una sequenza che riconosce un mRNA specifico (si possono avere siRNA che portano a degradazione di messaggeri diversi ottenuti per splicing alternativo anche di uno stesso gene). Questo impedisce la produzione del prodotto genico.! ! ! • microarrays: consentono di analizzare l’espressione di centinaia di geni simultaneamente ! ! INATTIVAZIONE DEL GENE A LIVELLO PROTEICO. Consiste nel blocco della proteina tramite inibitori chimici (enzimi), anticorpi inattivanti (recettori), induzione di modifiche post-traduzionali.! ! GENI REPORTER ! Per definire quando e dove un gene viene espresso, in cellule o animali transgenici, si possono utilizzare metodi di colorazione per evidenziare la presenza di un prodotto genico.! ! Due diversi embrioni con marcature differenti ottenute mediante reporter, cioè proteine di fusione in cui una parte è la proteina che si vuole analizzare, l’altra è un cDNA di una proteina che emette fluorescenza o di una proteina che è in grado di metabolizzare un substrato e date una reazione colorimetrica.! ! Come proteina di fusione, viene spesso usata la Green Fluorescent Protein espressa nella medusa A i i

! Con questo marcatore si può:! - studiare la localizzazione di proteine.! - studiare l’espressione delle proteine durante l’embriogenesi.! ! Quindi, per esempio, in un vettore di espressione è possibile inserire un promotore, la sequenza codificante del gene di interesse, la sequenza che codifica per GFP (in posizione indifferente rispetto alla sequenza del gene). Quando ci sarà il prodotto genico, si avrà una proteina con una porzione in più, costituita dalla GFP.! - studiare l’espressione delle proteine nell’adulto.! ! ! LA GENOMICA FUNZIONALE SU LARGA SCALA: LA TRASCRITTOMICA ! ! Comprende tutte le tecniche che consentono l’analisi del trascrittoma (mRNA presenti in una cellula in un particolare momento), dei geni espressi e della loro abbondanza relativa.! ! Queste tecniche sono:! ! - microarray, consentono l’analisi simultanea di migliaia di geni.! ! Ogni microarray è costituito da un supporto solido sul quale sono presenti sonde di DNA! differenti che possono essere complementari per molti mRNA dei geni esaminati.! ! L’RNA viene estratto dalle cellule, si ottengono cDNA a singolo filamento che vengono! ibridati a questi supporti. I cDNA sono marcati con un tracciante, per cui se l’RNA è! espresso nella cellula ci sarà il cDNA corrispondente, quindi nel pozzetto del microarray! ci sarà fluorescenza.! ! Si possono utilizzare due cellule o la stessa cellula trattata in modo differente, per il! confronto del trascrittoma.! ! Ad esempio, se i cDNA di una cellula possono essere marcati in rosso, quelli di un’altra in verde: al microarray avremo pozzetti solo rossi (espressione del gene in una sola delle cellule), solo verdi (espressione del gene solo nell’altra cellula) e pozzetti gialli (espressione equivalente del gene in entrambe le cellule).! ! Dalla colorazione possiamo determinare se e quanto un gene viene espresso.! ! I microarray possono essere applicati:! - nell’analisi dell’espressione genica;! - in studi sulle differenze dello sviluppo tra stati patologici e stati fisiologici; ! -analisi dei polimorfismi a singolo nucleotide; ! -identificazione della predisposizione a malattie e di splicing alternativo.! ! ! - RNA-seq, ovvero il sequenziamento dell’RNA con tecnologie di nuova generazione.! ! ! Innanzitutto viene estratto l’RNA del campione, viene frammentato e viene convertito in! cDNA con adattatori che serviranno per il sequenziamento di questi frammenti; ! ! se l’RNA è stato trascritto ci sarà una rappresentanza di frammenti maggiore rispetto al

caso in cui il gene non è trascritto o lo è poco. Così si ha una misura quantitativa! dell’espressione genica.! ! ! ! La tecnica è applicabile ad esoni di un unico gene o a più geni.! ! ! LA PROTEOMICA ! ! Analisi di tutte le proteine presenti in una cellula e della loro abbondanza relativa, in un dato momento. ! ! Questi studi possono essere effettuati mediante:! ! - separazione delle proteine con elettroforesi bidimensionale. ! Con un gel bidimensionale si separano le proteine in base al loro punto isoelettrico (migrazione delle proteine in un ambiente di pH in cui la loro carica è zero), poi il gel viene ruotato e! c’è una seconda separazione in funzione della loro massa. ! ! ! Si ottiene un pattern di “spot”, in cui proteine con diverse dimensioni che formano spot diversi, mentre spot a catena sono spesso formati da una stessa proteina che ha subito modifiche post-traduzionali che non cambiano le dimensioni della proteina ma la carica. Proteomi di cellule differenti o della stessa cellula prima e dopo un trattamento con farmaci saranno differenti.! ! ! ! - Identificazione delle sequenze proteiche con spettrometria di massa. ! Gli spot ottenuti con elettroforesi bidimensionale vengono digeriti proteoliticamente e! ionizzati, poi analizzati con uno spettrometro di massa che calcola il rapporto massa-! carica di ogni peptide in base al tempo percorso tra la sorgente ionizzante e il rivelatore.! ! Dai calcoli si ottengono grafici che consentono l’identificazione della sequenza! amminoacidica dei peptidi, la proteina di appartenenza e di eventuali modifiche post-! traduzionali (tramite confronto con banche dati).! ! - Analisi di modifiche post-traduzionali.! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! !...