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CURSO: Laboratorio de MicrobiologíaUNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIALA MOLINADEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍACURSO: MICROBIOLOGIA – LABORATORIOINFORME DE LA PRÁCTICA N° 1TÍTULO: OBSERVACIÓN DE BACTERIAS - TINCIÓN SIMPLEIntegrantes: Alumnos Código Cusi Aslla, Marcos 20161436 Hernandez Alberto, Milagros ...

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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA CURSO: Laboratorio de Microbiología

PRACTICA 1

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE BIOLOGÍA CURSO: MICROBIOLOGIA – LABORATORIO

INFORME DE LA PRÁCTICA N° 1 TÍTULO: OBSERVACIÓN DE BACTERIAS - TINCIÓN SIMPLE Integrantes: Alumnos

Código

Cusi Aslla, Marcos

20161436

Hernandez Alberto, Milagros

201614

Tasayco Goicochea, Luis

20161461

Ureta Atoche, Edmundo

20161462

Horario de práctica:

Viernes, 11:00 am – 1:00 pm

Profesora de laboratorio:

Ogata Gutierrez, Katty

Fecha de la práctica:

29/03/19

Fecha de entrega de informe:

05/04/19

LA MOLINA – LIMA – PERÚ I.

INTRODUCCIÓN

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PRACTICA 1

Los microorganismos, en especial las bacterias, pueden observarse directamente al microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo contraste entre las células y su entorno, estos procedimientos se utilizan en ocasiones muy limitadas por ello, en estos casos es conveniente usar colorantes. (García et al. 1994 La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la observación al aumentar notablemente el contraste. En nuestro trabajo utilizamos: azul de metileno , cristal violeta y carbol fucsina. (Gamazo et al. 2005). En Microbiología todas las tinciones se realizan a partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares. La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared celular. Básicamente, se diferencian según su forma en cocos (esféricas u ovaladas), bacilos (cilíndrica o de bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral); ( M. Pírez, M. Mota 1999) Los colorantes que se utilizan preferentemente son los básicos o nucleares derivados de la anilina (fucsina, cristal violeta, azul de metileno), debido a que el citoplasma bacteriano es muy basófilo. Estos colorantes generalmente se presentan asociados a un mordiente (ácido fénico) para reforzar su acción (García et al. 1994).

II.

OBJETIVOS ● Entender el proceso que se realiza para la preparación de una muestra fija de bacterias que serán estudiadas mediante el método de la tinción. ● Usar el método de tinción simple con (azul de metileno, cristal violeta y carbolfucsina) para colorear las muestras y observar mejor la estructura del microrganismo estudiado que en este caso fue la E. coli. ● Realizar el método correcto y uso del microscopio usando el aceite de cedro junto con el lente objetivo de inmersión para que la muestra se vea de una forma más clara.

III.

MARCO TEÓRICO

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Fundamento La tinción simple se basa en la afinidad del colorante por los componentes celulares. Puede ser uniforme o presentar algunos gránulos en su interior. Utiliza un solo colorante (violeta de genciana, azul de metileno, fucsina diluida). La tinción simple se utiliza para destacar el microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas. En las tinciones simples se usa un único reactivo, que preferentemente es de tipo básico y contiene un cromógeno (compuesto que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromógeno. Se utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple mejora la observación de la célula completa. Se fija el espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso de colorante y la preparación ya está lista para ser observada. Si se utiliza un mordiente (sustancia química utilizada para intensificar la coloración), hay que añadirlo justo antes del colorante. (Pérez, M, 2006)

Técnica Las tinciones simples se realizan sobre preparaciones previamente secadas. Sobre un portaobjetos con una suspensión de microorganismos previamente secada y fijada a la llama, se vierte una solución diluida de un colorante y se mantiene durante uno o dos minutos; a continuación se lava varias veces con agua y se seca. Debido a que las células son muy pequeñas, este tipo de preparación suele observarse con aceite de inmersión en la lente objetivo. (Covadonga, A. 2006)

Colorantes En la tinción simple se utilizan tintes como safranina, azul de metileno, cristal violeta y carbolfucsina. ● Colorante de carbolfucsina. Este colorante se prepara disolviendo 0,3% de fucsina básica (del grupo de triaminotrifenilmetano) en una solución de fenol de 5%. Para usarlo como

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colorante simple, se recomienda generalmente diluir la solución unas diez veces con agua destilada. ● Colorante de violeta cristal El violeta cristal es también un miembro del grupo de triaminotrifenilmetano. Químicamente es hexametil-p-ranilina. Se conoce también con el nombre de violeta de metilo, produce una matriz más intensa de las p-rosanilinas y, entre todos los compuestos violetas.

Figura 1. Estructura del cristal violeta ● Colorante Azul de metileno El azul de metileno es tetrametiltionina, colorante básico que tiene la siguiente fórmula: se observa un grupo tiacinas (grupo cromóforo) el azul de metileno del comercio suele ser una sal doble de colorante y cloruro de zinc; como este metal es tóxico, no debe usarse tal producto para fines medicinales. Por su condición fuertemente básica, tiñe con mucha intensidad núcleos y granules de ácido nucleico. (Salle, 1957)

Figura 2. Estructura del azul de metileno

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IV.

PRACTICA 1

MATERIALES Y MÉTODOS 1. Materiales Escherichia Coli. Es una bacteria miembro de la familia de las enterobacterias

y

forma

parte

de

la

microbiota del tracto gastrointestinal de animales homeotermos, como por ejemplo el ser humano. Es un bacilo gramnegativo, no exigente, oxidasa negativo, catalasa positivo, anaerobio facultativo, cuya temperatura de crecimiento

preferentemente es

37

ºC

(mesotermo), fimbriado y comúnmente es Figura 3. Cultivo del E,Coli móvil por flagelos perítricos.

Asa de Kölle. Es un instrumento de laboratorio que consta de una base que puede estar hecha de platino, acero, aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino, su aro generalmente mide unos 6 mm.. Su uso principal es trasvasar inóculos de un medio a otro. Figura 4. Asas de Kölle Portaobjeto. Es una fina placa de cristal sobre el cual se disponen

objetos

para

su

examen

microscópico. El objeto a observar suele disponerse sobre este artefacto para después situarse en el microscopio y ser observado.

Figura 5. Portaobjetos

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Mechero de alcohol. Mechero de uso habitual en laboratorios de química o biología ideal para el calentamiento de instrumentos de vidrio (tubos de ensayo, matraces, etc) o la esterilización de material metálico. Es una fuente de calor de baja intensidad que funciona con alcohol metílico. Figura 6. Mechero de alcohol 96° Piceta. Es un frasco cilíndrico de plástico o vidrio con una abertura parecida a la de una pajita, que se utiliza en el laboratorio de química o biología, para contener algún solvente, por lo general agua destilada o desmineralizada. Figura 7. Piceta de agua destilada

2. Metodología Actividad 1. Preparación de una muestra fija de bacterias para tinción. Se adhiere la muestra contenida de bacterias a una lámina portaobjetos; el procedimiento de fijación matará al organismo, coagulará el protoplasma y provocara su adhesión a la lámina de vidrio, el proceso de fijación se realizará con el calentamiento de la lámina. Actividad 2. Tinción simple con colorantes básicos. Esta técnica es utilizada para teñir los microorganismos lo cual permitirá contrastar y diferenciar los microorganismos. Cada colorante difiere del grado de reactividad con la célula. El azul de metileno reacciona con células cargadas negativamente a la tasa más baja, tomando de 20 a 30 segundos para teñir apropiadamente. El cristal violeta es más reactivo y solo requiere de 10 segundos. La carbolfucsina es un colorante aún más rápido, requiriendo solo 5 segundos.

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V.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN 1. Resultados Tinción por Azul de Metileno – Escherichia Coli

Figura 8. Por inmersión (100x de lente objetivo y 40x de lente ocular)

Tinción por Cristal Violeta – Escherichia Coli

Figura 9. Por inmersión (100x de lente objetivo y 40x de lente ocular)

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Tinción por Carbolfucsina – Escherichia coli

Figura 10. Por inmersión (100x de lente objetivo y 40x de lente ocular)

2. Discusiones Los tintes para la tinción simple se basan en el tamaño, arreglo y forma; es de un solo tinte y es directa (tiñe bacterias). Los tintes pueden ser básicos, agrupados de forma catiónica o aniónica; en el caso que sea catiónica, la porción del cromógeno tiene carga positiva y poseen gran afinidad por los compuestos celulares negativos. Los tintes más utilizados en este caso son el azul de metileno, cristal violeta y la carbolfucsina. Y en el caso sea aniónica, la porción del cromógeno es negativa y tiene gran afinidad por los componentes celulares positivos. Las sales de sodio, potasio, calcio o amoniaco de ácidos con color son ionizadas para producir un cromógeno con carga negativa, como lo puede ser la safranina. (Brook 10ed). En la práctica se pudo apreciar la coloración respectiva de la Escherichia coli tal cual se muestran en las figuras, ya que se usaron tintes catiónicos por ser la bacteria de carga negativa; y siguiendo meticulosamente los métodos se llega a comprobar con la teoría la tinción catiónica. Del mismo modo, el E.coli se aprecia con mayor nitidez al reaccionar con el cristal violeta, esto a su mayor afinidad entre las cargas iónicas tanto del colorante como también la naturaleza negativa de la pared celular de la bacteria.

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También la forma de bacilo apreciado en la Figura 9, indica que es más afín a reaccionar con reactivos debido a que su área superficial esta más expuesta a exteriores. Los representantes de esta especie son bacilos gramnegativos, oxidasa negativos, con un tamaño promedio de 1,1-1,5 µm de ancho y 2,0-6,0 µm de largo. De acuerdo a sus requerimientos de oxígeno son anaerobios facultativos. (Scheutz y Strockbine, 2005).

VI.

CONCLUSIONES ● La técnica de tinción simple nos permitió hacer visibles las formas, tamaños y agrupaciones que presentan los microorganismos. ● Se observaron los microorganismo en el microscopio, analizando su forma e interacción con diversos colorantes. ● El cristal violeto resulto ser el colorante con mayor afinidad al E.coli. ● En el uso de los colorantes para cada uno de las muestras; hay ciertas combinaciones óptimas como el cristal violeta, ya que azul de metileno con E.coli no es recomendable porque no se puede visualizar bien. ● El tiempo que debe estar la muestra bañada con la bacteria en uso es importante, debido a que si se dilata el tiempo al hacer esto podría perderse la muestra.

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VII.

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BIBLIOGRAFÍA ● BROOK. (2004). Biología de los microorganismos. México: Pearson. ● VERA GC (2004). Introduccion a la microbiologia. 2ed. Costa Rica. Editorial EUNED. 256 p. ● GARCÍA, P; FERNÁNDEZ DEL BARRIO, M; PAREDES, F. (1994). Microbiología clínica práctica. 2da ed. España-Cádiz p 31-35. ● GAMAZO, C; LÓPEZ, I; DÍAZ, R. (2005). Manual práctico de microbiología. 3ra ed. España. Barcelona p.24. ● FORBES, B et al.. (2009). Diagnóstico microbiológico. Madrid, España: Editorial Médica ● SCHEUTZ F. Y STROCKBINE N.A. GENUS I. (2005) Escherichia. In: Brenner, D.J., et al. (Eds.) The Protebacteria Part B The Gammaproteobacteria. Springer.; 2 (Part B) 607-623. ● SALLE, A.J.. (1957). Bacteriología. Barcelona: Gustavo Gili. ● PEREZ, M. MOTA, M.(2006) Morfología y estructura microbiana, Capitulo 2, p. 23-24 ● COVADONGA, A. (2010). Técnicas básicas de Microbiología. Serie Microbiología. 3 (5): 15-38. Madrid. España....