LABO samenvatting - Labo PDF

Preview

Summary

Labo...

Description

Hematologie Practicum Deel 1: Hematologisch Onderzoek Hoofdstuk 1: Complet 1. Het staal 1.1 Het bloedstaal  Capillair bloed: vinger prik, of hiel van baby  Veneus bloed: vena punctie  complet moet binnen de 48 uur na afname

1.2 Anticoagulantia Bloed onstolbaar maken 2 soorten:

- Onttrekken van Ca atomen  EDTA en natriumcitraat - Vorming van trombine remmers: heparine

Calcium is nodig voor bloedstolling EDTA-bloed: morfologie X uren behouden Bewaring:  

Erytrocyten: + 24uur op kamertemp Leukocyten: aanvaardbaar tot 16 uur o Beter op 4oC  Bloedplaatjes: meer dan 24uur op kamper temp EDTA-tubes = complet tubes Ethyleendiamine-tetra-azijnzuur ! nooit schudden!

2. Hematologische referentiewaarden Nu vaak via automatische cel tellers Waarden kennen

3. Hematocriet (Hct) 3.1 Principe = het volume samengeplakte RBC t.o.v. het totale bloedvolume ~ PCV = packed cell volume Onstolbaar gemaakt bloed centrifugeren Buffy coat: lichte laag WBC en PLT boven op de RBC 1 à 2 % ingesloten plasma

3.2 Microhematocriet Capillairen met binnendiameter van 1,1 mm Lengte van 75mm  centrifugatie in microcentrifuge

3.3 Aflezen van de hematocrietwaarde Totaal bloedvolume in buisje is recht evenredig met de lengte van het totaal bloed 1

(B) Lengte van het buisje vanaf grensvlak tussen plasticine en WBC tot aan bovenkant plasma Volume van de RBC is evenredig met de lengte van de RBC-massa (A) Lengte van het buisje vanaf het grensvlak tussen plasticine en RBC tot bovenkant RBC

Hct=

Lengte ( volume ) RBC massa A Lengte ( volume ) totaalbloed B

In duplo uit te voeren

3.4 Referentiewaarden Vrouw: 0,42 ± 0,05 [l/l]  42% ± 5% Man: 0,47 ± 0,07 [l/]  47% ± 7%

4. Bepaling van de hemoglobineconcentratie (Hb) of (HBG) 4.1 principe Standaardmethode: Fotometrisch: absorptie licht van bepaalde golflengte RBC worden eerste gelyseerd (interferentie)  hypotonische oplossing + niet-ionische detergent Recente methode: Laurylsulfaatmethode

4.2 Cyaanmethemoglobinemethode of Drabkinmethode Perifeer bloed bevat verschillende hemoglobine derivaten  elk eigen Amax Vb. desoxyhemoglobine, oxyhemoglobine, methemoglobe, sulfhemoglobine, ect Alles omzetten naar 1 stof  cyaanmethemoglobine HiCN met Amax = 540nm Hemoglobine + K3Fe(CN)6 (Kaliumferricyanide)  methemoglobine Methemoglobine + KCN (kaliumcyanide)  cyaanmethemoglobine Alle derivaten (uitzondering sulfhemoglobine) worden omgezet Te meten oplossing mag niet troebel zijn

4.3 Referentiewaarden Vrouw: 14,0 ± 2 g/dl Man: 16,0 ± 2 g/dl

5. Bürkertelkamer Concentratie aan RBC bepalen Telkamer van glas met 2 compartimenten met elk een Telnet Buitenzijde een groeve die 0,1mm hoger ligt  dekglaasje op rusten

Voorbereiding staal: Verdunning 1.) Reagens

RBC 200 maal Isotonische oplossing van NaCl (HAYEM)

PLT 100 maal Ammoniumoxalaat oplossing 1% vb. 495µL 2

vb. 995µL X µL vb. 5µL 40 kleine vierkantjes (Z=1/20mm) 1/10 mm Vrouw: 3,9-5,6*1012 RBC/L Man:4,5-6,0*1012 RBC/L Geelgroene cellen zonder kern

2.) bloed Aantal vakjes Diepte Ref. waarden Morfologie

X µL vb. 5µL 40 balkjes (z=1/20mm en 1/5mm) 1/10 mm 150-450*109 PLT/L kleine, blinkende, geelgroene structuren met onregelmatige vorm

Voorbereiding telkamer: 1. 2. 3. 4. 5. 6.

Reinig kamer met stomend leidingwater Droogkamer en dekglaasje af Breng speeksel aan op de steunbalken Schuif gaasje er voorzichtig op Vul hematocriet buisje met bloed en dek af met duim Vul de kamer in 1 keer

Telling: RBC: vierkantjes 3 volledige rijen + 2 random (13*3)+2 =40 PLT: balkjes 4*10 balkjes Tellen op 400x Condensor naar beneden en weinig licht 4 tellingen per staal

Resultaten:

cellen /L=

N c∗Fd∗1 06 n∗O∗D

Nc = aantal getelde cellen Fd = verdunningsfactor n = aantal getelde vakjes (40) O = oppervlakte van 1 vakje (mm2) (0,0025 voor RBC en 0,01 voor PLT) D = diepte van de telkamer (mm) 106 = factor om concentratie in liter uit te drukken in plaats van in mm 3

6. Concentratie van erytrocyten (RBC/l) 6.1 Principe Aantal RBC in een gekend volume verdund (200x) bloed te tellen Grootteorde van 5 miljoen RBC per mm3

3

6.2 werkwijze Bürkertelmaker

7. RBC-indices Telkens een quotiënt van 2 van de 3 RBC-parameters (RBC, Hct en Hb)

7.1 Gemiddeld Volume van de erytrocyten (MCV) Hct[l /l] MCV = RBC [ aantal/l] RBC-populatie naar volume geclassificeerd: micro, normo en macrocytair Referentiewaarden: 86 ± 10fL

7.2 Gemiddeld hemoglobinemassa van de erytrocyten (MCH) Hb [ g/l] MCH = RBC [ aantal/l] Classificatie: hypochroom, normochroom en hyperchroom Referentiewaarde: 29,5 ± 2,5 pg

7.3 Gemiddeld hemoglobineconcentratie in de erytrocyten (MCHC) g ∗10 Hb dl MCHC= Hct [l / l ]

[ ]

Classificatie: hypochroom, normochroom en hyperchroom Referentiewaarde: 32,5 ± 2,5 g/dl Mogelijke interferenties:  

+35 g/dl: uitdroging of verlies van membraanoppervlak Vals pos: - hemoglobine conc te hoog (troebeling, hyperlipemie of hoge leukocytose) - Hct onderschat door koude agglutininen

 goede criteria voor kwaliteit bewaking

8. Concentratie van bloedplaatjes (PLT/l) 8.1 Principe Aantal PLT in een gekend volume verdund bloed te tellen RBC moeten eerst gelyseerd worden  Bürkertelmaker

9. Factoren die het resultaat van de telling kunnen beïnvloeden       

Homogeniteit van de celsuspentie: goed mengen voor gebruik Nauwkeurigheid van de verdunning Vulling van de telkamer: mag niet overlopen, geen luchtbellen of te min gevuld zijn Diepteregeling in de telkamer Uitdroging van de inhoud Fouten bij tellen Mate waarin de te tellen cellulaire componenten van andere deeltjes kunnen onderscheiden worden

Hoofstuk 2: Formule 1. Cellulaire componenten in een normaal perifeer bloed 1.1 morfologie van de erytrocyten erytrocyt = discocyt biconcave, schijfvormige cel zonder kern del = centrale opheldering 4

1.2 Morfologie van de leukocyten *monoculeair (MN): kern uit 1 deel  lymfocyten en monocyten * Polynucleair (PMN): kern met segmenten  granulocyten 1.2.1 lymfocyten * Kleine: ronde cel met ronde kern, donkerblauw zonder korrels *grote: ovaal of onregelmatig, lichtblauw cytoplasma, helderrode korrels (5 tot 15) 1.2.2 Monocyten Grootste cel met onregelmatige vorm en kern Lichtroze kern met grijsblauw cytoplasma 1.2.3 Neutrofiele staven of staafkernige granulocyt Kern niet verdeeld in lobben maar als een staaf Insnoering is niet kleiner dan 1/3 van de totale dikte kern 1.2.4 Neutrofiele segmentkernige granulocyt Kern verdeeld in 2 tot 5 segmenten Soms nog met elkaar verbonden Cytoplasma is rozerood met paarsrode korrels 1.2.5 Eosinofiele segmentkernige granulocyt 2 tot 3 lobbige kern Oranje kleur 1.2.6 Basofiele segmentkernige granulocyt Kleiner dan de rest 2 tot 3 lobben met grof chromatine Zeer donker paarsblauwe kleur

1.3 Morfologie van de trombocyten Platte, kernloze cel fragmenten Grijsblauwe cytoplasma met rood/paarse granulen

2. Levenscyclus van de neutrofiele granulocyten Circuleren X uren in perifeer bloed en gaan dan naar de weefsels voor X dagen Sterven af in de weefsels na X dagen (gaan niet terug naar perifeer bloed) Morfologische kenmerken van apoptosis: 

Pyconische segmenten o Condensatie van de kernchromatine o Veel dense structuurloze lobben, vaak ronde vorm Niet verwarren met erytroblasten

3. referentiewaarden van een perifeer bloedstaal van een volwassenen Erytrocyten Leukocyten Trombocyten Staafkernige granulocyten Neutrofiele segmentkernige granulocyten

Aantal M: 4,5 - 6,0 x 1012/L V: 3,9 - 5,6 x 1012/L 4,0 - 10,0 x 109/L 150 - 450 x 109/L 2,5 – 7,8 x 109/L

Percentage

0–5% 35 – 79 % 5

Lymfocyten Monocyten Eosinofiele segmentkernige granulocyten Basofiele segmentkernige granulocyten

1,2 - 3,6 0,2 - 0,8 ≤ 0,4

x 109/L x 109/L x 109/L

20 – 50 % 2 – 10 % ≤6%

≤ 0,1

x 109/L

≤1%

4. Microscopische bepaling 4.1 inleiding Formule ~ differentiatie van de leukocyten Automaten: 1.000 cellen verdelen in 5 groepen Microscoop: 100 cellen beoordelen op:     

Grootte, vorm, kleur en ligging RBC Inclusies RBC Morfologie WBC Ligging en grootte trombocyten Schatting aantal trombocyten

4.2 Uitzicht van de cellulaire componenten op een bloeduitstrijkje Afhankelijk van de plaats zijn er meer of minder (bepaalde) cellen aanwezig Door kleven aan draagglaasje worden ze vervormd  artefacten Ideale zone = vlak achter de tandjes ~ de vlam Kanteelmethode om 100 leukocyten te tellen // st / sgt / Eo / Ba / Ly / Mo

4.3 Principe van een May-Günwald-Giemsa (MGG) kleuring Panoptische kleuring = mengsel zure en base kleurstoffen * May-Günwald kleurstof: eosine(zuur) + methyleenblauw in absolute methanol (fixatie) * Griemsa: eosine + methyleenblauw + methyleenzuur (purperrood, contrast) met water als oplosmiddel Oplossing worden in een buffer gemaakt  pH regulatie Basische kleurstoffen kleuren de zure delen blauw/paars granulen, NZ (DNA/RNA), componenten in de granulen  cytoplasma is blauw Zure kleurstoffen kleuren de basische delen roos/oranje Hemoglobine, basische eiwitten, eosinofiele granulen 4.3.1 bloeduitstrijkje maken Vloeiende beweging Hoek van 45o Nummeren met potlood 4.3.2 kleuring met kleurbrug FIXATIE  3 min onverdunde May-Grünwald stock (1ml) KLEURING   

+1ml fosfaatbuffer (3ml) niet afspoelen o Voorzichtig mengen met staafje Kleurstof afgieten Spoelen met fosfaatbuffer 6



15-20min 3ml 20x verdunde Giemsa-werkoplossing (12 druppels Giemsa + 8ml fosfaat buffer)  Kleurstof afgieten  Spoelen met stromend leidingwater  Rechtopstaand laten drogen met tandjes naar boven 4.3.3 Kleuring met kleurbakjes  

3 min fixeren in absolute methanol 5min kleuren in May-Grünwald werkoplossing 1 deel MG + 1 deel fosfaatbuffer

 

Spoelen in fosfaatbuffer bakje 15-20min Giemsa werkoplossing 1 deel G + 19 delen fosfaatbuffer

 

2 bakjes met leidingwater om te spoelen Laten drogen met tandjes naar boven

Hoofdstuk 3: Erytropoëse 1. Inleiding Ontwikkeling van pluripotente stamcel tot erytrocyt  verschillende tussenstadia “maturatie” Onrijpe cellen normaal enkel in beenmerg Aanmaak van RBC wordt gestimuleerd door EPO

2. Morfologie van erytroblasten Grootte van de cel en verhouding kern met cytoplasma neemt af Kern wordt kleiner en chromatine steeds denser Cytoplasma van donkerblauw naar roos

2.1 Pro-erytroblast Jongste voorloper cel Ovaal met ronde kern die 8/10 volume inneemt 1-2 nucleolen Cytoplasma: donkerblauw door RNA Capaciteit van 4 delingen

2.2 Basofiele erytroblast Kern is kleiner met denser chromatine Geen nucleolen Cytoplasma is basofieler  meer RNA

2.3 polychromatische erytroblast Cel is kleiner Kleinere kern met groffer kernchromatine Cytoplasma al meer oranjebruin

2.4 Orthochromatische erytroblast Kleinste met kern Zeer kleine kern met heel grof chromatine Kern meestal excentrisch gelegen Cytoplasma bruinroze Cel gaat kern uitstoten 7

2.5 Reticulocyt Onrijpe erytrocyt met RNA  cel kan nog Hb synthetiseren 2 dagen rijpen in: toename in Hb conc Rijping tot erytrocyt: onregelmatige vorm tot biconcaaf

2.6 Rijpe erytrocyt Eindstadium, leeft 120 dagen

3. Erytropoëse activiteit Oude RBC te vervangen met nieuwe Elke dag gaan er 1/120 RBC vervangen worden door nieuwe Indien zuurstof levens in de weefsels daalt zal erytropoëse gestimuleerd worden Signaal EPO geregeld in de nieren door de zuurstof te meten Bij een toename van de erytropoëtineconcentratie zal: (1) de levensvatbaarheid van de erytrocyten toenemen (2) versnelde overgang van reticulocyten in perifeer bloed (3) vervroegde uitstorting van de kern (4) erytroblasten vergaten BM en gaan naar PB (5) 1 of meer celdelingen worden overgeslagen  macro-erytroblasten en macrocyten (6) maturatie wordt versneld Zware hypoxie: 1.000 maal proces versnellen Vaak gepaard met macrocytose, reticulocytose en erytroblastosis

4. Reticulocytose Maat waarmee reticulocyten in het perifeer bloed voorkomen Referentiewaarde: 0,5 tot 2,0% (20-100 *109/l) Normaal: 1 reticulocyt op 120 RBC 3 methoden om reticulocytose te schatten

4.1 Polychromasie Reticulocyten bevatten nog RNA en kleuren dus donkerder met de MGG kleuring Schatting maken o.b.v. bloeduitstrijkje Enkel goed als screening Uitvoering 1. In ¼ gezichtsvels bepalen van a. Aantal RBC b. Aantal reticulocyten 2. Omrekenen naar #reticulocyten/1.000RBC 3. Vergelijken met criteria a. Lichte toename 1+: 3-10/1.000 RBC b. Matige toename 2+: >10-20/1.000 RBC c. Sterke toename 3+: >20/1.000 RBC

4.2 Vitaal cresylblauw kleuring Speciale kleuring die “reticulum” aankleurd 1000 RBC tellen en verhouding maken met aantal reticulocyten Te veel variantie en menselijke fouten

4.3 Fluorescentie en flowcytometrie Fluoroforen die selectief aan RNA of DNA binden Automatische cel tellers 8

Meest betrouwbaar

Hoofstuk 4: Morfologische afwijkingen van de erytrocyten 1. Inleiding Vorm, grootte en hoeveelheid Hb van een erytrocyt kan in verschillende situaties afwijken Belangrijk voor de diagnostiek

2. Afwijkingen in grootte 2.1 anisocytose/anisoplanie Grootte verschillen in grootte Microcyten, macrocyten of beide Weergegeven door RDW

2.2 Microcytose/microplanie Meerdere RBC hebben kleiner opp dan normaal Deel van de cellen of allemaal kleiner MCV kan nog binnen ref waarde liggen RDW is verhoogd

2.3 Macrocytose/macroplanie Meerde RBC hebben groter opp dan normaal Deel of alle cellen MCV kan binnen waarden liggen RDW is verhoogd

3. Afwijkingen in kleur 3.1 Hypochromasie/hypochroom Minder Hb zichtbaar  lichte cellen Centrale opklaring meer dan 1/3 diameter ~anulocyten Vb. Fe-gebrek, chronische ziekte, thalassemie

3.2 Hyperchromasie/hyperchroom ~sferocyten Zichtbaar meer Hb Cellen zijn donkerder van kleur Bijna geen centrale opheldering Vb. congenitale sferocytose, immunologische hemolyse

3.3 Polychromasie Grote hoeveelheid recitulocyten aanwezig Grijsblauwe cellen: Hb en RNA bevatten Macrocytaire cellen

4. Afwijkingen in vorm (=poikilocytose)  productie abnormale erytrocyten in beenmerg  beschadiging van normale erytrocyen in de bloedsomloop

4.1 Ancantocyten 1 of meer afgeronde puntige uitsteeksels Ongelijk in lengte en onregelmatig verspreid  leveraandoeningen, hemolytische anemie 9

4.2 Echinocyten/doornappelcellen Veel puntige uitsteeksels Labo artefarct Snelle uitdroging bloeduitstrijkje Contact met hyperosmolaire vloeistoffen  lever of nier aandoeningen, hemolytische anemie

4.3 Elliptocyten/ovalocyten/potloodcellen Min of meer langwerpige vorm Elliptocyten: sigaar vorm, lengte =2x breedte Ovalocyten: eivormig Podloodcellen: langgerekt met een “puntig” einde  fe-gebrek, ferriprieve anemie

4.4Fragmentocyten Stukjes van RBC met allerlei vormen Keratocyten: speciale vorm waarbij horentjes gevormd worden  nieraandoeningen

4.5 targetcells/schietschijfcellen Hemoglobine in het midden en aan de randen Biconcave vorm is verdwenen Cellen hebben kleinere inhoud dan hun vorm

4.6 Sikkelcellen Misvormde RBC met 2 puntige uiteinden Aanwezigheid staafvormige polymeren van hemoglobine S  sikkelcelanemie

4.7 Stromacellen Spleetvormige del “babybel”  levercirrose

4.8 Traan(druppel)cellen 1 kant uitgerokken tot een uitsteeksel Artefarct als allemaal zelfde richting  sideroblastische anemie

5. Afwijkingen door inclusies in de erytrocyten 5.1 parasieten  malaria

5.2 Basofiele stippeling Kleine fijne of dikkere donkerblauwe korrels Verspreid over de gehele cel

5.3 Pappenheimbodies Donkerblauwe korrels Dichter op elkaar

10

5.4 ring van cabot Resten van de kerndeling in voorlopers Lusvormige paarde ringen (per 2) Weinig relevant

5.5 Heinz-bodies/ HbH-lichaampjes Gedenatureerd hemoglobine Speciale kleuring

5.6 Howell-Jolly-bodies Kernresten die bij een normale miltfucntie verwijderd worden Middelgrootte, bolronde, compacte paarsrode inclusies

6. Afwijkingen in ligging 6.1 Rouleaux vorming Geldrollen In de ideale zone

6.2 Agglutinatie Onregelmatige groepen RBC Door overmaat aan positief geladen eiwitten Vb. Antilichamen

7. Uitbereiding differentiatie van perifeer bloeduitstrijke 7.1stappenplan 1. 2. 3. 4.

Differentiatie WBC Let op aanwezigheid van erytroblasten Schatting van polychromasie Beoordeel morfologische afwijkingen in de erytrocyten (400x) a. Verdeel veld in kwadranten b. Bepaal totaal aantal RBC c. Vermenigvuldig met 4 d. Tel het aantal afwijkende cellen (soort per soort) e. Bereken # afwijkende/1.000RBC f. Greef een gradatie (1- tot 3+) m.b.v. bijlage 5. Vul onderstaande tabel in op ……… geteld erytoblasten blasten promyelocyt myelocyt metamyelocyt neutrof. Staven neutrof.segmet Eosinofiel segment

WBC toxische korreling hypogranulatie RBC anisocytose poikilocytose hypochromie polychromasie Howell-Jolly

hypo-/hypersegmentatie geactiveerde lymfocyten micro/macro/megalo …………………………………. anulocyt/tagetcel basofiele korreling Pappenheimer 11

Basofiel segment Lymfocyt Monocyt

PLT aggregaten Andere:

-3 -2 -1 0 +1 +2 +3 reuze PLT

Hoofdstuk 5: Megakaryocytopoïese of Trombopïese 1. Inleiding Aanmaak trombocyten in beenmerg gestimuleerd door verschillende hormonen Vb. trombopoëtine (TPO), IL-6, Gm-CSF,…

2. Morfologie van trombocyten Uitrijpingssequentie…

2.1 Megakaryoblast – MK I N:C ratio  10:1 Kleine compacte rond/ovale kern Fijn kernchromatine met nucleolen Blauw cytoplasma met enkele granula

2.2Progemakaryocyt – MK II N:C ratio  4:1 tot 7:1 Hoefijzerachtige of onregelmatig gelobde kern Grover chromatine met meerde nucleolen Lichter blauw cytoplasma, toenemend # granula

2.3 Granulaire megakaryocyt – MK III N:C ratio  2:1 tot 1:1 Sterk gelobde kern of meerder kernen zonder nucleoli Nog grover chromatine Paarsblauw cytoplasma Doorsneden met membranen

2.4 Megakaryocyt – MK IV N:C ratio  2:1 tot 1:1 Sterk gelobde kern of meerder kernen zonder nucleoli Cytoplasma met trombocytenvelden

2.5 Trombocyten Platte, kernloze cytoplasmafragmenten Afkomstig van megakaryocyten Cytoplasma: grijs tot lichtblauw met rood-violette granula Levensduur 8 tot 10 dagen

3. Schatting van de trombocyten ~ analoog aan erytrocyten 12

1. Verdeel veld in kwadranten 2. Bepaal totaal aantal RBC 3. Vermenigvuldig met 4 4. Tel het aantal afwijkende cellen (soort per soort) 5. Bereken # afwijkende/1.000RBC 6. Greef een gradatie (1- tot 3+) m.b.v. bijlage 7. Vergelijk het gemiddelde trombocyten volume (MPV) met de ref. waarden 8. Controleer op aggregaten 9. Noteer resultaten in tabel Citraattube: resultaat * 1,1 Reuzenbloedplaatjes Vals verhoogde RBC/WBC conc Vals verlaagde PLT Macrotrombocytopenie

Hoofdstuk 6: Automatisatie 1. Inleiding Volautomatische toestellen  doorstroomanalysetoestellen of flowcytometers Te onderzoeken staal wordt verdund en meegevoerd in vloeistofstroom Elektronische verwerkte resultaten 2 hoofdsusupenties maken: * één in functie van analyses leukocyten en Hb * één in functie van analyses erytrocyten en trombocyten ~ sterker verdund 2 hoofdprincipes: * impedantiemetingen * lichtverstrooiing

2. Basisprincipes 2.1 Elektrische impedantiemetingen Bloed opgezogen door meetoplossing Constant potentiaalverschil door 2 electroden verbonden aan DC Bloedcellen geleiden minder stroom Verschil in weerstand = impeda...