Samenvatting labo immunologie tussentijdse toets PDF

Preview

Summary

Immunologie – tussentijdse toets laboLabo’s K. DuranAlgemeenAntilichaam Fab - Fc Zwarte keten - Lichte keten Antigeen-bindingsplaats à beide kanten - Zwavelbruggen Variabel deel (VL/VH) - Constant deel (CL/CH1,2,3) Lichte ketens Zware ketens Kappa () of lambda () - MAGED: mu () = IgM alpha () = IgA ...

Description

Immunologie – tussentijdse toets labo Labo’s K. Duran Algemeen Antilichaam - Fab - Zwarte keten - Antigeen-bindingsplaats à beide kanten - Variabel deel (VL/VH)

Lichte ketens - Kappa () of lambda () - Beide en bij ≠ isotypes - Slechts 1 type per AL

- Fc - Lichte keten - Zwavelbruggen - Constant deel (CL/CH1,2,3)

Zware ketens - MAGED:

mu () = IgM gamma () = IgG delta () = IgD - Bepalen isotype AL

alpha () = IgA epsilon () = IgE

AL-AG complexen

  

Agglutinatie (aggregatie) tot gevolg Complexen = reversibele niet-covalente bindingen AG + AL AG-AL Interacties verstoord door - Zoutconc. ↗ - Extreme pH - Competitie met ↗ conc. van pure epitoop zelf - Detergenten

AL-AL complexen

paard anti-konijn IgG = AL

2 AL gaan samen interactie aan konijn IgG = AG

Curve van Heidelbergher

Prezone effect

Postzone effect

Terug oplosbare complexen ontstaan Aanvankelijk gevormd immuunprecipitaat gaat terug in oplossing door toevoeging overmaat AG 1

Immunofixatie = precipitatietechniek = AL-AG complex en neerslagvorming ↓ , affiniteit thv epitoop of antigene determinant  DOEL: opsporing monoklonale en polyklonale gammapathie  Elektroforese serumeiwitten (IEF) scheiding obv netto-lading o Eiwitten (negatief geladen) migreren van negatieve  positieve pool obv lading + massa  

AL = anti-humaan immunoglobuline AG = human immunoglobuline



Enkelvoudige geldiffusie = enkel ANTILICHAAM of ANTIGEEN kan zich verplaatsen RID (radiale immunodiffusie), rocket (elektro-immunodiffusiemethode) en immunofixatie Dubbelvoudige geldiffusie = zowel ANTILICHAAM als ANTIGEEN kunnen zich verplaatsen Ouchterlony en immuno-elektroforese



vb anti-IgG vb IgG

Waarom immunofixatie enkelvoudige geldiffusie? AG (humaan serumproteïnen) vast in de agarose pre-cast gel Aanbrengen AL (anti-serum) AL migreren naar AG

Principes 1) Eiwitelektroforese 2) Fixatiestap (SP) + AL-AG complex precipitatiereactie vb IgG-anti-IgG complex 3) Wasstap = complex/precipitaat blijft in gel, andere eiwitten weggewassen 4) Kleuring zichtbaar voor oog

Interpretatie

Monoklonale gammapathie = plasmacellen produceren 1 bepaald type abnormale immunoglobuline (M-proteïne) Multiple myoloom (ziekte van Kahler), ziekte van Waldenström, Chronische lymfatische leukemie, lymfomen Polyklonale gammapathie = plasmacellen produceren ≠ types immunoglobulines Inflammatoir proces, chronische leverpathologie, metastases van carcinoom, (auto)immuunziekten, AIDS  SP = immunofixatie eiwitband  Monoklonale gammapathie: naar positie scherpe lijnen kijken fijne intense band  Polyklonale Ig: normaal, verlaagd, sterk verlaagd, afwezig bredere minder intense band(en)  Breedte piek ~ breedte band  Hoogte piek ~ intensiteit band

2

 Kleurloze zone in midden van SP ↗ conc. AG in staal postzone effect einde curve van Heidelberger, geen precipitatie, geen kleuring Oplossing: hogere verdunning staal nemen

Controles 

SP-band Correct verloop elektroforese Indicatie postzone effect (kleuring SP band niet door complexvorming, maar chemische precipitatie fixatief)  Puntjes onder laantjes van lichte en zware ketens o Correct anti-serum aangebracht o o

Andere zaken Waarom serumstalen en geen plasmastalen? Serum = gestold bloed gecentrifugeerd geen stollingsfactoren Plasma = ongestold bloed gecentrifugeerd stollingsfactoren zorgen voor fibrinogeenband tss en stollingsfactoren zijn eiwitten: interferentie! Kleuring  Na verwijderen van vrije AL/AG in gel  Kleuring bindt enkel op precipitatie o Laantjes: AL-AG complexen precipitatie kleurstof zichtbaar door precipitatie o SP-band: zure oplossing van fixatief eiwitten chemisch precipiteren zorgt voor precipitatie Reagentia

Elektroferogram

Albumine beweegt verst (meest negatief geladen)

 Monoklonale gammapathie = piek gammazone

3

Rapitex RF = kwalitatieve passieve agglutinatietest RF = reumafactor Agglutinatie = speciale vorm van precipitatie partikel die precipitaat (Ag-Al complex) zichtbaar maakt Passief = Ig’s reeds aanwezig op drager    

Titerbepaling mogelijk indien reagens serieel wordt verdund Drager = latex/polystyreen partikels Ig coating = humaan IgG Detectielimiet ±20 IU/ml

Rapitex RF kit met PC, NC en reagens

Reumatoïde artritis (RA) = auto-immuunziekte  70-80% vorming van RF = Ig’s gericht tegen Fc van IgG (diverse oorsprong mogelijk)  RF = meestal IgM (kan ook IgG of IgAzijn)  RF op 3 ≠ manieren aantonen o Kwalitatief = Rapitex RF o Semi-kwantitatief = titerbepaling: WR en Serodia o Kwantitatief = turbidimetrie (kalibratielijn van licht door troebel)

Interpretatie  

Complexvorming indien RF (een pentameer) aanwezig (!) RF is (vaak) IgM bindt à Fc gedeelte van IgG complexvorming waarnemen als klontervorming

Numme Staal r 1 Positieve controle 2 Negatieve controle 3 Serumstaal 4 Serumstaal Controles voldoen à verwachtingen

Waarneming

Kwalitatieve bepaling: RF aanwezig?

Agglutinatie Geen agglutinatie: witachtig Geen agglutinatie: witachtig Agglutinatie resultaten betrouwbaar kan wijzen op RA

Ja, die > 20 IU/ml is Neen, tenzij < 20 IU/ml Neen, tenzij < 20 IU/ml Ja, die > 20 IU/ml is

WR (Waaler-Rose) = semi-kwantitatieve passieve indirecte hemagglutinatietest titerbepaling 

Gemeenschappelijk principe Rapitex RF

4

(Hem)agglutinatie Agglutinatie = verschijnsel AL reageren met AG op een drager binding en klontering Hemagglutinatie = idem agglutinatie met drager rode bloedcellen

Titerbepaling

ELI.H.A RF kit

Titer = reciproke waarde van sterkste verdunning die nog positieve reactie geeft conc. ↘ waarbij hemagglutinatie optreedt, is maat voor RF (IgM) aanwezig in serum patiënt Titer in IU/ml = noemer verdunning (onbenoemde titer) x gevoeligheid R1 (staat op kit) Seriële verdunning = telkens van voorgaande verdunning om volgende verdunning te maken + VF constant (serumverdunning/eindverdunning) In elk cupje 50 µl pipetteren in cupje 1 50 µl stock pipetteren mengen en telkens 50 µl overbrengen LAATSTE VERDUNNING HIER WEL IN HAC in labo: serum 1/20 verdund, dan telkens VF 2x tot 20480

Dragers Gesensibiliseerde drager = drager voorzien van Ig’s Niet-gesensibiliseerde drager = drager niet voorzien van Ig’s

Inhoud ELI.H.A RF kit - R1: gesensibiliseerde partikels schapen RBC + IgG’s konijn anti-schaap RBC - R2: niet-gesensibiliseerde partikels schapen RBC - BUF: fosfaatbuffer pH 7.2 (verdunningsoplossing) - PC: humaan serumstaal + RF (IgM) - NC: humaan serumstaal zonder RF - Microtiterplaten: V-vormige titerplaten - R3: absorbant, niet-gesensibiliseerde schapen RBC - Druppelteller (1 druppel 15 -20 µl)

Interpretatie 

Titer + IU/ml met gevoeligheid op kit titer 640 x 0,2 IU/ml = 128 IU/ml



Serumstaal RF titer van ... IU/ml, kan wijzen op RA Controles voldoen à verwachtingen, resultaten betrouwbaar

Controles Serumcontrole buffer + 1/20 serumverdunning + niet-gesensibiliseerde partikels VERWACHTING: negatief resultaat/geen hemagglutinatie want nt-gesens. partikels, gn immunoglobulines gebonden op rbc KAN OOK: vals positief/hemagglutinatie patiënt AL opgebouwd tegen schapen RBC Oplossing: R3 gebruiken, absorbeert AL Reagenscontrole buffer + gesensibiliseerde partikels VERWACHTING: negatief resultaat/geen hemagglutinatie INDIEN TOCH POSITIEF: contaminering of auto-contaminering door veroudering

5

Negatieve controlereeks VERWACHTING: nergens hemagglutinatie Positieve controlereeks VERWACHTING: titerwaarde (zie flesje) max. 1 cupje afwijken van verkregen waarde

vb 320 vs 640 is OK.

Hoe vals positief bij serumcontrole vermijden? Oplossing: absorptie techniek R3 toevoegen à serum en enkel supernatans kan gebruikt worden na centrifugatie (!) Serum is dan 1/4 verdund: dit nogmaals 1/5 verdunnen in BUF 1/20 R2 en R3 zijn niet verschillend Hoe reageert positieve controle van WR bij Rapitex RF? - PC WR = humaan RF ⇒ AL - Partikels Rapitex RF = latexpartikel gecoated met humaan Ig ⇒ AG interactie (complex AL-AG) mogelijk (!) Detectielimiet Rapitex RF 20 IU/ml (titer PC bij WR moet boven 80 zijn indien gevoeligheid van reagens gelijk is aan 0,2)

Prozone effect Curve Heidelberger (!) Door prozone effect kan WR niet gebruikt worden als sneltest vals negatieven lagere verdunning(en) Resultaat indien men de PC (titer serumdilutie 80) van Serodia zou gebruiken als staal bij Rapitex RF en WR?  Rapitex RF: negatief resultaat gebruik gemaakt van humane IgG’s ipv konijn IgG’s  WR: positief resultaat positieve controle reageert met het anti-konijn

Rapitex CRP = agglutinatietest DOEL: controleren of therapie (behandeling) werkt  CRP = C-reactief proteïne ⇒ aangemaakt in lever als reactie op ontsteking/infectie  CRP-waarden hoogst bij bacteriële infecties Virussen leiden tot gematigde CRP-waarden  Acute fase eiwit o Hoogste piek meetbaar 6 -8u na ontstaan ontsteking/infectie o Snel terug afgebroken ⇒ na 9 -12u reeds gehalveerd

Verschil Rapitex RF en Rapitex CRP   o o  o o

≠ in oriëntatie van AL op partikel RF IgM RF op partikels = rol AL RBC met AL = rol AG CRP Ig op partikel = rol AL CRP = rol AG

Vals positieve reactie RF

Reactie absorptiereagens en RF

Inhoud Rapitex CRP kit - Reagens: latexpartikel met IgG’s = schaap anti-CRP - RF absorbent: schaap IgG’s

- PC: humaan serum (CRP ± 10 mg/l) - NC: humaan serum (CRP max 1 mg/l)

Interpretatie - Lijkt op PC = super sterk - Meer agglutinatie dan NC = zwak

- Agglutinatie iets minder dan PC = sterk - Lijkt op NC = super zwak

mate van agglutinatie

Postzone effect

conc. CRP

LOD Rapitex CRP LOD volgens bijsluiter Rapitex CRP = 6 mg/l LOD volgens de waarden van het labo = 0,6 ⇒ eenheid is dus mg/dl

Andere Prozone bij WR analyt is AL Postzone bij Rapitex CRP analyt is AG

Werkcollege L. Seys Immunofixatie = elektroforese SP = serumeiwitten slaan neer + aankleuren

Andere lanen: Ig’s aankleuren

- SP: scherp-afgebakende densiteit gammaglobulines - Bij IgG op zelfde hoogte piek in kappa-laan IgG kappa monoklonale gammapathie

- SP: M-proteïne piek aanwezig - Enkel duidelijke band bij kappa lichte keten Antisera verkeerd aangebracht OF light chain disease

7

M-proteïne = scherpe piek (meestal gamma globulines) met scherp afgebakende band = monoklonale stoornis Monoklonale stoornis = van 1 kloon veel eiwitten geproduceerd Alle banden minder intens = polyklonale stoornis Light chain disease = enkel lichte ketens worden geproduceerd

- 3 monoklonale banden: IgG, IgA en IgM oligoklonaal - IgM met lambda lichte keten - Band in lambda laan is denser dan bandje in IgM laan Lambda en IgM met elkaar gebonden Of IgG of IgA zal bijdragen à hoeveelheid lambda positief signaal

Reumafactor opsporen = agglutinatietesten Rapitex RF Serodia RA

Waaler-Rose (RW)

Rapitex RF Negatieve controle = behandeld human serum, onder detectielimiet (1-5 IU/ml)

WR RF aanwezig in serum binnen detectiemogelijkheden van test agglutinatie tot staal te ver verdund is (Heilderbergher) Negatieve controle = niet-gesensibiliseerde schaap RBC tegen veeartsen enzo: antilichamen opgebouwd (!) Prozone effect

Rapitex CRP = indicator voor inflammatie/infectie detectielimiet is 5 IU/ml Serieuze infectie zorgt voor CRP ↗↗ = agglutinatie

Naamgeving antilichamen Organisme waarin AL opgewekt / immunisatie gebeurd + anti-AG waartegen AL opgewekt vb AL tegen ratten T cellen: anti-rat CD3 + Ig subtype vb IgG2a Vb IgA in muizen aankleuren, AL gemaakt door rat: Rat anti-muis IgA IgG

8

- (!) Lieven geen humaan anti-humaan kruisreacties - Meerdere ≠ antilichamen gebruiken beter WANT: dan kan je beide AL tegelijk in zelfde stap op weefsel aanbrengen - Secundaire AL merken door: 1 met HRP en 1 met AF, of elk met andere fluorescerende merker geëxciteerd door andere laser

ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA zijn heterogene EIA = in ieder type ELISA moet de vrije van de gebonden fractie gescheiden worden  Zeer sensitief (tot in femtogrammen (10-15 gram) o Secundaire AL o Amplicatiekits  Kwantitatief  Makkelijk aangepast à specifiek AG

 Analyt is primair AL  Sec. AL zorgt voor kleuromzetting

 Hoeveelheid kleuromzetting omgekeerd - (AG-)conjugaat in oefening = competitie principe evenredig met - Blocking in oefening = sandwich principe conc. analyt  Recombinant + natuurlijk

9...