Samenvatting labo immunologie eindtoets PDF

Preview

Summary

Immunologie – eindtoetsInleidingAangeboren immuniteit Adaptieve immuniteit Snel - Traag Niet-specifiek - Zeer specifiek Macrofagen, neutrofielen, - T-cellen en B-cellen eosinofielen, mastcellen Antilichamen Fab en F(ab’)2 - Fc Zwarte keten - Lichte keten AG-bindingsplaats à beide kanten - Zwavelbrug...

Description

Immunologie – eindtoets Inleiding Aangeboren immuniteit

Adaptieve immuniteit

- Snel - Niet-specifiek - Macrofagen, neutrofielen, eosinofielen, mastcellen

- Traag - Zeer specifiek - T-cellen en B-cellen

Antilichamen - Fab en F(ab’)2 - Zwarte keten - AG-bindingsplaats à beide kanten - Variabel deel (VL/VH)

- Fc - Lichte keten - Zwavelbruggen - Constant deel (CL/CH1,2,3)

Lichte ketens - Kappa () of lambda () - Beide en bij ≠ isotypes - Slechts 1 type per AL

Zware ketens - MAGED:

mu () = IgM gamma () = IgG delta () = IgD - Bepalen isotype AL

alpha () = IgA epsilon () = IgE



Binding AG-AL o Zeer specifiek o Reversibel o Verzameling niet-covalente bindingen (H-ionisch, hydrofobisch en Van Der Waals)



AG-AL binding kan worden verbroken o Indien meer specifiek AL toegevoegd o Zoutconc. ↗ o Toevoeging detergenten o Afwijkende pH

Productie van AL   

Productie constante grote hoeveel B-cellen in beenmerg Elke B-cel herkent 1 epitoop van specifiek AG Herkenning complementaire AG B-cel gaat delen (= prolifereren) AG-specifieke B-cellen produceren AL o Specifiek voor lichaamsvreemde stoffen o Specifiek voor lichaamseigen stoffen auto-immuniteit  B-cellen kunnen in secundaire lymfeorganen (lymfeklieren, milt) verblijven o Lymfe en bloed voeren continu AG aan  B-cel kan van klasse veranderen signalen uit omgeving (vb T-cellen) = constante deel AL verandert

vb MS, RA

Epitoop = toegankelijk deel van AG

1

(Kruisimmuniteit wanneer epitopen op elkaar lijken)

Woordenschat Immuno = chemische AG-AL immuunresponsreactie, lichaam produceert AL Agglutinatie = aggregaten van immuuncomplexen na toevoeging partikels Precipitatie = zichtbare neerslag↓ van immuuncomplexen, bij ↗ conc. Assay = test ter bepaling hoeveelheid bepaald bestanddeel van een mengsel Immunoassay = test die immuuncomplexen (AG-AL complexen) gebruikt om meetbaar resultaat te genereren gevoelig: kunnen ↘ conc. analyt opsporen

Werkcolleges L. Seys Werkcollege 1 Immunofixatie = elektroforese Normaal serum - Alle te detecteren klasses zichtbaar: IgG, IgA, IgM - Geen scherp afgebakende densiteiten - Lichte ketens: 60% kappa + 40% lambda

SP = serumeiwitten slaan neer + aankleuren

Andere lanen: Ig’s aankleuren

- SP: scherp-afgebakende densiteit gammaglobulines - SP: M-proteïne piek aanwezig - Bij IgG op zelfde hoogte piek in kappa-laan - Enkel duidelijke band bij kappa lichte keten IgG kappa monoklonale gammapathie Antisera verkeerd aangebracht OF light chain disease M-proteïne = scherpe piek (meestal gamma globulines) met scherp afgebakende band = monoklonale stoornis Monoklonale stoornis = van 1 kloon veel eiwitten geproduceerd Alle banden minder intens = polyklonale stoornis Light chain disease = enkel lichte ketens worden geproduceerd

- 3 monoklonale banden: IgG, IgA en IgM - IgM met lambda lichte keten

oligoklonaal

2

- Band in lambda laan is denser dan bandje in IgM laan Lambda en IgM met elkaar gebonden Of IgG of IgA zal bijdragen à hoeveelheid lambda positief signaal

M-p + la

Rap Negatieve controle = behandeld human serum, onder detectielimiet (1-5 IU/ml)

WR RF aanwezig in serum binnen detectiemogelijkheden van test agglutinatie tot staal te ver verdund is (Heilderbergher) Negatieve controle = niet-gesensibiliseerde schaap RBC tegen veeartsen enzo: antilichamen opgebouwd (!) Prozone effect

Reumafactor opsporen = agglutinatietesten Rapitex RF

Waaler-Rose (RW)

Serodia RA

3

Rapitex CRP = indicator voor inflammatie/infectie detectielimiet is 5 IU/ml Serieuze infectie zorgt voor CRP ↗↗ = agglutinatie

Naamgeving antilichamen Organisme waarin AL opgewekt / immunisatie gebeurd + anti-AG waartegen AL opgewekt vb AL tegen ratten T cellen: anti-rat CD3 + Ig subtype vb IgG2a Vb IgA in muizen aankleuren, AL gemaakt door rat: Rat anti-muis IgA IgG - (!) Lieven geen humaan anti-humaan kruisreacties - Meerdere ≠ antilichamen gebruiken beter WANT: dan kan je beide AL tegelijk in zelfde stap op weefsel aanbrengen - Secundaire AL merken door: 1 met HRP en 1 met AF, of elk met andere fluorescerende merker geëxciteerd door andere laser

ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA zijn heterogene EIA = in ieder type ELISA moet de vrije van de gebonden fractie gescheiden worden  Zeer sensitief (tot in femtogrammen (10-15 gram) o Secundaire AL o Amplicatiekits  Kwantitatief  Makkelijk aangepast à specifiek AG

4

 Beperkte hoeveelheid AL nodig

 Overmaat AL nodig

 Analyt is primair AL  Sec. AL zorgt voor kleuromzetting

 Hoeveelheid kleuromzetting omgekeerd - (AG-)conjugaat in oefening = competitie principe evenredig met - Blocking in oefening = sandwich principe conc. analyt  Recombinant + natuurlijk

Werkcollege 2 AL in immunoassays Immunoassays gebaseerd op AG-AL interacties Analyt AL, AG, of AL in rol van AG Antigen inbrengen immuunreactie vorming plasmacellen productie AL isoleren AL

proefdieren

Hapteen = kleine molecule dient als epitoop, op zichzelf niet in staat AL respons op te wekken er is een carriereiwit molecule nodig om als AG op te reden Antigeen = substantie die op specifiek AL kan binden Immunogeen = substantie die immuunrespons kan opwekken Niet alle AG zijn immunogeen, maar alle immunogenen zijn AG

Niet-immunogeen AG opsporen nodige AL verkrijgen door:  AG te binden op dragereiwit vb BSA (Bovine serum albumin) of BTG (Bovine Thyroglobuline) o Koppelen à vrije aminogroepen / carboxylgroepen o Plaats binding bepaalt specificiteit  AG toedienen in adjuvans = versterkte chemisch effect vb Freunds adjuvans Monoklonale AL = alle AL herkennen zelfde epitoop op zelfde AG Polyklonale AL = mix van AL die ≠ epitopen herkenne op zelfde AG

Monoklonale AL opwekken Hybridoma = groepjes niet-gefusioneerde B-cellen ver over hun ouderdom  Hybridomas van myeloma cellen (onsterfelijk) + plasmacellen uit milt van geïmmuniseerd dier  1 cultuur miltcellen + myelomacellen ≠ hybridomas met elk eigen affiniteit voor bepaald epitoop beste hybridoma geselecteerd tegen best bereikbare epitoop of hoogste affiniteitsconstante 

Plasmacellen produceren AL van 1 klasse + 1 specifiek subtype



1 affiniteitsconstante

vaak muis

Ig1, IgG2a, IgG4 = monoklonaal (!)

5

Polyklonale AL opwek ken 

ALTIJD opgewekt in andere diersoort dan herkomst AG

  

Niet alle AL binden met zelfde epitoop Niet alle AL opgewekt in proefdier hebben zelfde affiniteit voor epitoop Niet alle AL zijneven specifiek voor AG kruisreactiviteit



Hoeveelheid opgewekte AL ↗ + affiniteit van opgewekte AL voor hun epitoop ↗ met # keren proefdier à AG werd blootgesteld o Somatische hypermutatie = random mutaties in variabel deel AL Mutanten binden niet beter dood Mutanten binden beter delen + AL produceren o Class switching recombination = veranderen constant deel AL (klasse) Biologische activiteit AL ↗ Geen impact op affiniteit



Mix van AL met elk hun eigen affiniteitsconstante

Affiniteit en aviditeit Affiniteit = bindingsterkte tss 1 epitoop en 1 AG-bindend deel van AL (1 Fab – 1 epitoop) Aviditeit = totale bindingsterkte tss AL en AG doordat epitoop bindt in AG-bindend deel van AL (= paratoop), afhankelijk van: = nagaan recente infectie affiniteit # bindingsplaatsen bindingssterkte door conformatieveranderingen (3D structuur)

Zuiveren van AL 

Polyklonale AL Indien conc. AL ↘ in antiserum veel ↗ andere EW in vgl met AL in serum AL met ↗ affiniteit voor AG als er veel ↗ niet-specifieke AL aanwezig zijn in serum  Monoklonale AL o Idem poly o Soms nodig om AL van andere geproduceerde EW of celfragmenten te scheiden eiwitchromatografie o o

Specificiteit  o o 

Kruisreactiviteit = AL reageren met epitoop gelijkaardig epitoop op ander AG Meer bij polyklonale AG mix ≠ AL Monoklonale AG reageren met 1 epitoop kans ↘↘ dat dit epitoop ook op AG zit Interferentie EW in antiserum of hybridoma supernatans

Secundaire AL   

(Bijna) altijd polyklonaal Te kopen als: antisera, IgG’s, Fab of F(ab)2 Gericht tegen host primaire antilichamen o Tegen Fc deel o Tegen zware en lichte ketens van ≠ Ig’s

Indirecte assays

vb anti-rat IgG (H+L) IgGs

Directe assays 6

Voordelen + Amplificatie signaal mogelijk + Reactie met primair AL onafhankelijk van label

+ Snel: 1 AL + Geen secundaire AL + Geen kruisreactiviteit mogelijk door secundair AL + Zelfde primair AL kan ≠ keren gebruikt worden + ≠ fluorochromen tegelijk gebruiken

Nadelen - Achtergrondsignaal door secundair AL - Extra incubatiestappen nodig - Primair en secundair AL evenwicht nodig - Tijd

- Reactie van primair AL kan ↘ - Weinig mogelijk tot amplificatie signaal

Vorming IgM en IgG na 1e en 2e contact AG

Immunoassays

via zichtbare precipitatie, toevoeging hulpmiddelen of merkers Specifieke binding immunoglobulines à welbepaalde AG om 1 bepaald eiwit op te sporen + conc. te meten Methode met lage LOD (µg/ml tot pg/ml)

Zichtbare precipitatie 





Kwalitatief of semi-kwantitatief o In waterige oplossing: zichtbare precipitatie kwantitatief afgelezen met meettoestel immunoefolometrie, immunoturbidimetrie o In gel: semi-kwantitatief door toevoeging kleurstof precipitaat zichtbaar maken

 Enkelvoudige gel immunodiffusie enkel AG diffunderen radiaal in gel  Dubbele gel immunodiffusie zowel AG als AL diffunderen in gel AL kan met 2 AG complex vormen complexen vormen aggregaten aggregaten bepaalde grootte = onoplosbaar immuunprecipitaat

Precipitatiecurve van Heidelbergher

7

o o

Evenwicht tss hoeveelheid AG en AL neerslag↓ immuuncomplexen precipitatie Kleine immuuncomplexen blijven in oplossing

Prezone effect  o o

Postzone effect

Terug oplosbare complexen ontstaan Aanvankelijk gevormd immuunprecipitaat gaat terug in oplossing door toevoeging overmaat AG

Fab van AL bindt op epitoop AG 1 AG kan ≠ epitopen hebben 1 monomeer AL kan theoretisch 2 epitopen binden behorend tot 1 AG of 2 ≠ AG

Toevoeging hulpmiddelen    

partikelagglutinatie, complementfixatie, neutralisatie Indien hapteen ipv AG, conc. analyt ↘ of prezone/postzone Geen of weinig detecteerbare immuuncomplexen Partikels gecoat met AL om AG te detecteren Partikels gecoat met AG om AG-specifieke AL te detecteren (!) Minstens 2 epitopen nodig anders geen agglutinatie mogelijk door ↘ AL-AG conc.



Membraaneiwitten op RBC zijn - geladen RBC trekken kationen (+) aan RBC met + geladen watermantel

 

IgG in immunohematologie: incompleet AL IgM overbrugt in immunohematologie: complete AL

Complementfixatietest - Matrix : serum patient - Analyt: AL in serum - Reagentia toevoegen in volgorde: 1) AG specifiek voor AL dat we willen vinden 2) Complement dmv serum van cavias met gekende hoeveelheid complement 3) Schapen RBC Als het AL aanwezig is in serum [Ag-Al] complexen complement geactiveerd + geen lyse van RBC

Merkers

8

  

Enzymatisch, fluorescent, chemiluminescent of radio-labelled Enzymatische merkers: HRP (horde radish peroxidase), AP (alkalische fosfatase) Detectieapparatuur

4 eigenschappen merkers - Immunoreactiviteit tracer moet behouden blijven - Merker stevig vast op AL of AG - Gemerkt AL of AG = chemisch zuiver - Merker moet ↗ meetsignaal uitsturen hoe ↗ meetsignaal, hoe gevoeliger bepaling

Overige belangrijke reagentia en factoren in immunoassays Kalibratoren Standaard ≠ kalibrator Standaard = bevat zelfde analyt in dezelfde matrix als te meten analyt Kalibrator = bevat zelfde analyt in een andere matrix of recombinante vorm analyt

Incubatie  

Buffers: pH Temperatuur o ↗ temp sneller resultaat + aspecifieke bindingen o ↗ temp merker mogelijk instabiel

Scheidingsystemen 

Neerslaan immuuncomplexen o Via eiwitprecipitatie: analyt mag geen eiwit zijn o Via immunoprecipitatie met secundaire AL  Gebonden fractie op vaste drager o Micropartikel o Well plate  Magnetische scheiding o Celpopulatie selecteren

Hemagglutinatie Directe hemagglutinatie Bloedgroepbepaling

Indirecte hemagglutinatie

= passieve

WR

Overzicht practica Zichtbare precipitatie: immunofixatie Toevoeging hulpmiddelen: rapitex RF, rapitex CRP, Waaler-Rose, Serodia RA Merkers: Western Blot Line immunosassay (LIA), indirecte immunofluorescentie, ELISA, Vidas automatisatie

9

Werkcollege 3 LIA – Line Immunoassays (Borrelia) 

Humane anti-borrelia IgG = ziekte van Lyme  Line immunoassay o Opsporen specifieke AL: autoziektes, HIV 1 en 2 o Matrix: serum o Indirect principe  Primair AL mogelijk in serum  Secundaire AL geconjugeerd met merker  Staal < wasssen < conjugaat < wassen < substraat o Enzym: alkalische fosfatase o Substraat (paars)  ~ western blotting o Membraan o AG van 1 ziekte aangebracht o Serum toevoegen: slechts 1 aandoening/membraan

LIA versus klassieke western blot LIA - Geen elektroforese nodig - Strip = membraan - Eenvoudig

Western blot - Alle EW kunnen opgespoord worden - Veel ≠ matrices kunnen gebruikt worden

Serumcontrole is serumstaal aangebracht? Conjugaatcontrole binding? 3e controle TpN17 treponema vals positief mogelijk, niets te maken met Borrelia Cutoff controle positieve controle met lage titer alles donkerder dan deze intensiteit is positief

Indirecte immunofluorescentie (IIF) Toxoplasma gondii   

Glaasjes met gefixeerde AG Titer Principe o AL-AG binding + sec AL met fluorescerende merkerlabel signaal via fluorescentiemicroscoop

Waarom RF absorbent toegevoegd (bij IgM bepaling)? Interferentie Toxo IgG en RF bij bepaling Toxo IgM uitsluiten Te groot complex gevormd tss Toxo IgG, RF absorbent en RF, verhindert binding op AG RF geeft vals positieve reactie Alleen IgG’s, geen IgM’s infectie lang geleden Zowel IgG’s als IgM’s meerdere testen nodig want reeds lang infectie Vals negatieven uitsluiten Als conc. Toxo IgG’s >>> conc. IgM’s vals negatief voor IgM Alle AG bezet door IgG meerderheid IgG’s vastgebonden à RF en weggewassen, meer kans voor IgM’s om te binden

10

Toxoplasma gondii ELISA + aviditeitstest ELISA Indien positief dan pas aviditeitstest mogelijk  Enzym: HRP  Principe: indirect, AL + HRP  H2SO4 om reactie tss enzym en substraat te stoppen = stopoplossing Anders door tijd: elke staal positief  Resultaat = omzetting binnen bepaalde tijdspanne  Analyt: IgG  Reagens: AG, sec. AL, standaarden  Matrix: serum  Substraat: TMB (tetramethylbenzidine, specifiek voor HRP)

Aviditeitstest  

IgM traag ↘ , IgG snel ↗ Sommatische hypermutaties: varianties in variabel deel zorgt voor affiniteit ↗ en aviditeit ↗

 

Reagens: ureumoplossing Strip met wells kleuromzetting

door B-lymfo’s

Substraatcontrole enkel substraat toegevoegd, om achtergrondsignaal substraat te meten 2 positieve controles (high and low avidity PC) controle met ↘ en ↗ aviditeit ! Laat je lang genoeg inwerken, zal ↗ aviditeit ook breken !

Aviditeit (%) = > 60-65% < 30% 30-65%

infectie lang geleden of op herinfectie als secundaire respons zeer recente infectie (ook foetussen opvolgen) nieuwe test na x weken uitvoeren zelfde aviditeit: geen hoog # AL aangemaakt = milde infectie of infectie snel afgebroken hogere aviditeit: infectie nog niet zo lang geleden

11

Mini-vidas automatisatie   

Enzyme linked fluorescent immunoassay ELFI Reagensstrip + bijhorende tips Serologie, AG detective en microbiologie mogelijk

 

Kalibratie door inlezen barcode (1 per batch) Verdere herkalibratie elke 2 weken met 1 kalibrator

Niet goedkoop: ≠ kits voor elk op te sporen analyt

Extra oefeningen ELISA zijn heterogene EIA = in ieder type ELISA moet de vrije van de gebonden fractie gescheiden worden Homogene EIA = vrij en gebonden fractie blijven samen aanwezig, signaal en conc. recht evenredig

ELISA protocol   

Coating buffer badje zo goed mogelijk à plastic coaten Incubatie korter incuberen met ↗ °C kan ook Verdunnen met assay diluent (buffer) om in standaardcurve te vallen



Capture AL = sandwich principe alle niet-gebonden capture AL met PBC/Tween-20 wegwassen PBS = detergent = vloeistof goed verspreid over opp./wells



Blocken

 

Duplo (of triplo) verschillend in condities wat wegwerken (HOK-effect) HOK-effect = als conc. AG ↗ krijg je een vals negatief respons door: 1) Meer verdamping 2) Minder verdamping + ontvangst verdamping wells errond ↘ °C aspecifieke bindingen ↘



Biotine-Streptavidine hoge affiniteit/aviditeit Streptavidine = enzymreagens

met irrelevant niet-bindend eiwit gaan coaten alle niet-bedekte plaatsen bezetten zodat 2e AL niet gaat binden op plastic 1 2

ELISA figuren - Principe: indirect - Enzym: HRP - Analyt: Sars-CoV2-AL - Matrix: serum - Reagens: 2e AL

- Principe: competitie ~ kleuromzetting (omgekeerd evenredig) - Niet gebonden fractie was je weg

Homogene EIA 12

Haptenen opsporen drugs + medicijnen

Fluorescentie Flowcytometrie, immunofluorescentie Immunohistochemie = enzymmerkers, weefselstructuur nog te zien Immunofluorescentie = tot 812 ≠ merkerskleuren (!) Bij HRP slechts 2 kleuren

Labo’s K. Duran Algemeen AL-AG complexen

  

Agglutinatie (aggregatie) tot gevolg Complexen = reversibele niet-covalente bindingen AG + AL AG-AL Interacties verstoord door - Zoutconc. ↗ - Extreme pH - Competitie met ↗ conc. van pure epitoop zelf - Detergenten

AL-AL complexen

paard anti-konijn IgG = AL

2 AL gaan samen interactie aan konijn IgG = AG

Immunofixatie = precipitatietechniek = AL-AG complex en neerslagvorming ↓ , affiniteit thv epitoop of antigene determinant  DOEL: opsporing monoklonale en polyklonale gammapathie  Elektroforese serumeiwitten (IEF) scheiding obv netto-lading o Eiwitten (negatief geladen) migreren van negatieve  positieve pool obv lading + massa  

AL = anti-humaan immunoglobuline AG = human immunoglobuline



Enkelvoudige geldiffusie = enkel ANTILICHAAM of ANTIGEEN kan zich verplaatsen RID (radiale immunodiffusie), rocket (elektro-immunodiffusiemethode) en immunofixatie Dubbelvoudige geldiffusie = zowel ANTILICHAAM als ANTIGEEN kunnen zich verplaatsen Ouchterlony en immuno-elektroforese



vb anti-IgG vb IgG

Waarom immunofixatie enkelvoudige geldiffusie? AG (humaan serumproteïnen) vast in de agarose pre-cast gel Aanbrengen AL (anti-serum) AL migreren naar AG

Principes 1) Eiwitelektroforese

13

2) Fixatiestap (SP) + AL-AG complex precipitatiereactie vb IgG-anti-IgG complex 3) Wasstap = complex/precipitaat blijft in gel, andere eiwitten weggewassen 4) Kleuring zichtbaar voor oog

Interpretatie

Monoklonale gammapathie = plasmacellen produceren 1 bepaald type abnormale immunoglobuline (M-proteïne) Multiple myoloom (ziekte van Kahler), ziekte van Waldenström, Chronische lymfatische leukemie, lymfomen Poly...