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ENZIMAS DE RESTRICCION Laboratorio Biología Molecular Universidad de Pamplona, Pamplona Norte de Santander. 28 de Octubre de 2016 ABSTRACT: The key to transgenesis (obtaining genetically modified organisms) is to extract DNA fragments of our interest to introduce them into other organisms, obtaining...

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ENZIMAS DE RESTRICCION Laboratorio Biología Molecular Universidad de Pamplona, Pamplona Norte de Santander. 28 de Octubre de 2016 ABSTRACT: The key to transgenesis (obtaining genetically modified organisms) is to extract DNA fragments of our interest to introduce them into other organisms, obtaining new, more desirable characteristics, thanks to the restriction enzymes, better known as cutting molecular shears The DNA. These enzymes are the ones that have allowed us to extract DNA fragments and advance a lot in molecular biology studies, followed by the discovery of the ligase enzymes which are fundamental in the DNA restriction processes, whose function implies the union of the Fragments extracted upon introduction into other organisms to form a recombinant DNA. Both essential enzymes in molecular biology and genetic ing. KEYWORDS: Restriction enzymes, ligase, blunt cut, cohesive cut, Temperature, enzymatic digestion. RESUMEN: La clave de la transgénesis (obtención de organismos genéticamente modificados), está en la extracción de fragmentos de DNA de nuestro interés para introducirlos en otros organismos obteniendo nuevas características más deseables, esto gracias a las enzimas de restricción, más conocidas como tijeras moleculares que cortan el DNA. Estas enzimas son quienes nos han permitido extraer fragmentos de DNA y avanzar mucho en los estudios de la biología molecular, seguido a esto también se descubrieron las enzimas ligasas las cuales son fundamentales en los procesos de restricción del DNA, cuya función implica la unión de los fragmentos extraído al ser introducidos en otros organismos para así formar un DNA recombinante. Ambas enzimas esenciales en la biología molecular y la ing genética. PALABRAS CLAVES: enzimas de restricción, ligasa, corte romo, corte cohesivo, Temperatura, digestión enzimática.

INTRODUCCIÓN Las enzimas de restricción están encargadas de cortar fragmentos de DNA para luego ser sometidos a estudios ya sea PCR o electroforesis, estos procedimientos deben ser llevado a cabo con mucha precaución debido a que cualquier factor en el medio puede darnos malos resultados, también debemos tener en cuenta la velocidad con la que la enzima trabaja por lo que es muy importante el estudio de la velocidad de una reacción catalizada por una enzima y los efectos que pueden tener factores como los inhibidores. Uno de los principales estudios que se realizan en una enzima es medir el efecto en la velocidad de la reacción cuando se modifican las concentraciones del sustrato y se mantienen constantes la concentración de enzima, el pH, la fuerza iónica del medio, la temperatura, entre otros.[1] Como ya lo hemos nombrado las enzimas de restricción son proteínas cuya función es cortar las hebras de ADN. Se podría decir que son “tijeras moleculares” que cortan ADN. Lo hacen en forma específica. Esto significa que cada enzima reconoce un sitio particular del ADN, es decir que reconoce una secuencia particular de nucleótidos. Esa secuencia específica para cada enzima se denomina “sitio de restricción”. Una vez que la enzima reconoce estos sitios, se posiciona sobre la molécula de ADN y corta dentro o en torno de esa secuencia.

Acorde a como realizan el corte, las enzimas se pueden clasificar en: Enzimas que generan “extremos romos” (parejos) Enzimas que generan “extremos cohesivos” (desparejos). Estos extremos “colgantes” de simple cadena pueden pegarse con otros extremos de cadena simple que tengan la secuencia complementaria. Las enzimas encargadas de unir los extremos de ambas cadenas se denominan ligasas. [2]

Imag 1. Corte Romo y cohesivo

Las enzimas de restricción reconocen secuencias de 4, 6 o más bases y cortan generando extremos romos o extremos cohesivos.

reacción o que se entorpezca manteniendo siempre unos patrones de temperaturas específicos para cada enzima. Es de suma importancia la utilización de buenos equipos para tomar las cantidades exactas de cada reactivo ya que de no ser así se afectaría la acción enzimática. Y lo más importante es la disposición de tiempo ya que en nuestro caso no se termino la practica por falta de este y por ende no se logró hacer una de las partes más importantes la cual era la electroforesis, con la que analizaríamos si en realidad hubo una digestión enzimática por parte de la enzima HindIII.

Los

BIBLIOGRAFÍA Imag 2. Digestión con EcoRI (cohesivo)

extremos, generados en diferentes moléculas de ADN, pueden sellarse con la enzima ADN ligasa y generar así una molécula de ADN nueva, denominada recombinante. [3]

[1]http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm (referenciado día 08/12/2016) [2] http://porquebiotecnologia.com.ar/index.php? (referenciado action=cuaderno&opt=5&tipo=1¬e=34 día 08/12/2016)

METODOLOGÍA En el procedimiento se utilizó fago landa, el cual se cortó con la enzima de restricción HindIII. Se tomó 1µl de DNA del fago landa y se adiciono en un tubo de eppendorf, a este se le agrego el tampón para mantener las condiciones óptimas de la enzima 2µl de buffer, y por último se agregaron 16,5 µl de agua destilada para un volumen total de 20 µl, posteriormente se llevó el tubo a la incubadora durante 2 horas a 37˚C para luego realizar electroforesis. (No se realizó electroforesis por falta de tiempo y disposición del laboratorio). Posterior a este procedimiento dejamos la incubadora programada y nos dirigimos a la sala de biotecnología para divulgar sobre este tema en las páginas científicas encontradas en internet, en donde se encontraron temas como los tres tipos de enzima y la función de cada una de estas (Enzima tipo I, II y III), también se indago como realizar mapas de restricción y las transformaciones y cortes generados por las diferentes enzimas como el corte romo y cohesivo. Resultados No se lograron observar los resultados por falta de tiempo y disposición del laboratorio.

Conclusión La temperatura es un factor determinante para la actividad enzimática porque esta puede hacer que la enzima acelere su

[3] https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dnatechnology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dnaligase (referenciado día 08/12/2016) [4] http://academic.uprm.edu/~jvelezg/EnzimasDNA.htm (Referenciado día 08/12/2016) [5] https://es.wikipedia.org/wiki/Enzima_de_restricci %C3%B3n (Referenciado día 08/12/2016)...