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Informe de laboratorio lleno de preparación de medios de cultivo...

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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

Práctica # 02 ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. OBJETIVOS -

Familiarizar al estudiante con las técnicas básicas utilizadas en el laboratorio de microbiología, preparación de medios de cultivo y esterilización del material de laboratorio. Aprender las técnicas de preparación de medios de cultivo de diferentes clases y su forma de esterilización.

2. INTRODUCCION ESTERILIZACIÓN Es el proceso de destrucción de toda vida microbiana. El término estéril es absoluto; algo está estéril o no lo está. El proceso de esterilización remueve todos los microorganismos que pueden estar presentes en los materiales y medios de cultivo. Se puede esterilizar por varias vías: con el uso de agentes físicos (calor), radiación, filtración o agentes químicos (desinfectantes). Se debe tener en cuenta el tipo de material y medio de cultivo para aplicar un tipo de esterilización adecuado, este dependerá de la sensibilidad térmica de los materiales. Todos los medios de cultivo deben estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante) aplicando 121°C por 15-20 minutos a un presión de 1 atmósfera (15 PSI). MEDIOS DE CULTIVO Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. Un medio de cultivo es un sustrato estéril que contiene elementos inhibitorios o nutricionales que permiten o regulan el crecimiento y la multiplicación bacteriana. El crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. Preparación de medios de cultivo La introducción y perfeccionamiento de los medios de cultivo, ha significado un adelanto

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL fundamental en bacteriología permitiendo el aislamiento, estudio e identificación de bacterias. Se preparan según las indicaciones precisas del productor (Merck, Gibco, Sigma, etc.). Comúnmente se pesa la cantidad de medio requerida y se hidrata con agua destilada, para luego solubilizar con calor durante un tiempo establecido por el fabricante. Clasificación de medios de cultivo Según el estado físico, que depende de la concentración de agar en la composición del medio de cultivo, se clasifican en:  Sólidos: 1 – 2% agar  Semisólidos: 0,2 - 0,5% agar  Líquido: 0% Según la composición, se clasifican en:

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Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos, poseen material nutrido pobre. Constituyen la base para la preparación de otros medios más elaborados. Ej. Caldo peptonado, agar nutritivo. Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiben el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, EMB, Baird Parker) Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (caldo Selenito cistina). Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación; SIM, TSI).

3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 MATERIALES Pipetas Cajas petri Tubos de ensayo Tapas plásticas autoclavables Frascos para medios de cultivo (autoclavables) Autoclave Balanza Espátulas Folia de aluminio Erlenmeyer Medios de cultivo Agua destilada

3.2 MÉTODOS

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3.2.1 PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 1. Preparar los medios de cultivo deshidratados, siguiendo estrictamente las indicaciones del fabricante:  Pesar e hidratar con la mayor exactitud posible  Durante la disolución, cubrir la boca del matraz con papel aluminio (evita la formación de espuma y el derrame del medio) y hacer un agujero pequeño (para dejar salida al vapor)  Disolver completamente el medio, evitar quemar la parte inferior del recipiente.  Colocar la tapa del frasco autoclavable 2. Esterilizar en autoclave. 3.2.2 DISTRIBUCIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 1. Preparar un área estéril (mesa, alcohol, mechero ó usar cámara de flujo laminar). 2. Marcar las cajas petri (en la base) y tubos de cultivo. Indicaciones generales: medio de cultivo, grupo de trabajo, fecha. 3. Distribuir suavemente el medio de cultivo, a temperatura óptima (45°C): a. Cajas petri: 15-20 ml aproximadamente b. Tubos de cultivo: i. Medios líquidos: 2-3 ml ii. Medios semilíquidos: 2-3 ml iii. Medios sólidos: 6-10 ml 4. Una vez solidificados, proteger de la humedad cubriéndolos con folias de aluminio debidamente rotuladas: a. Cajas petri de vidrio: colocar una sobre otra en grupos de 4-6 cajas. b. Tubos de cultivo: en latas de metal cubiertas por folia de aluminio y rotuladas. 5. Almacenar en refrigeración. 3.2.3 PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL 1. Tubos de ensayo: con su debido tapón de algodón y gasa en frascos, o con tapa autoclavable, en una lata y cubiertos con folia de aluminio (rotular) 2. Pipetas: envolver con folia de aluminio (señalar la ubicación de la punta) ó usar tubos esterilizadores para pipetas. 3. Cajas Petri de vidrio: envolver con papel kraff o folia de aluminio (puede usarse también papel reciclado) 4. Cajas Petri desechables: envolver en folia de aluminio 5. Hisopos: poner en botella de vidrio con tapa 6. Baja lenguas: cubrir con folia de aluminio. 7. Frascos de medio de cultivo: sin cubrir, únicamente tapados, rotulados con marcador en las paredes del frasco. 8. Agua destilada: en botella de vidrio con tapa. Colocar en el autoclave (programar para que alcance 121ºC y mantener a esta temperatura durante 15-20 minutos a 1,2 atmósferas de presión). Al término de este proceso el material se encuentra listo para utilizar, no obstante hay que tomar varias precauciones para evitar su posterior contaminación. 4. CUESTIONARIO DE INVESTIGACIÓN

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1. El fabricante de un medio de cultivo líquido, da como instructivo de preparación “disolver 42.8 g de medio EMB en 786 mL de agua destilada”. ¿Cuánto se debe pesar del medio, si se desea preparar 45 cajas Petri con 10 mL cada una? 45cajas Petri * 10 ml = 450 ml 42.8g-------786ml X ------- 450 ml

Se debe pesar 24,5 g

2. ¿Por cuánto tiempo puede permanecer un medio de cultivo ya preparado y estéril en la nevera?

El tiempo de vida del medio de cultivo depende de su naturaleza al igual que de la temperatura a la que se vaya a conservarlo, las condiciones medio ambientales y de la hermeticidad de los recipientes: * Tubos con tapones de algodón 3 semanas * Tubos con tapones de presión 2 semanas * Recipientes con tapón de rosca 3 meses * placas Petri, en bolsas de plástico herméticamente cerradas 4 semanas Al colocar en la refrigeradora los medios preparados se deben colocar los de más reciente preparación al fondo y los más viejos adelante. Es recomendable almacenar por debajo de los 20°C y protegido de la luz a los medios de cultivo , los medios de cultivo con agar no deben guardarse por debajo de los 0°C, ya que se alteraría su estructura del gel.

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3. Complete la siguiente tabla. MINIMO 3 EJEMPLOS POR TIPO DE MEDIO TIPO DE MEDIO SÓLIDO

EJEMPLOS Agar TSI ( triple sugar iron) Agar Sabouraud

USO Se utiliza para aislar e identificar bacterias, ya que no posee nutrientes

Agar cetrimida

SEMISÓLIDO Agar de Hugh-Leiffson Agar de sangre

Se puede utilizarlos para determinar la motilidad de los gérmenes

aghar motilidad

LÍQUIDO

Caldo peptonado Caldo nutrititivo Agar Tripticase Soya

Se utiliza para la investigación del metabolismo proteico de algunos microorganismos.

Caldo tioglicolato .

5. BIBLIOGRAFIA - Merck. 2002. Microbiology Manual. Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos - Collins C.H, Lyne Patricia, Métodos Microbiológicos Edición Acribia, S.A, Zaragoza, España, quinta edición. -...