Inmuno Práctica 3 Precipitación en fase líquida PDF

Preview

Summary

Práctica de laboratorio...

Description

Universidad Simón Bolívar Facultad de Ciencia y Tecnología Licenciatura en Químico Farmacéutico Biólogo Laboratorio de Inmunología Práctica No. 3 Reacciones de precipitación en fase líquida (tubos capilares)

Introducción La precipitación de los complejos antígeno-anticuerpo en solución, ha sido utilizada desde 1920 para la cuantificación de antígenos y anticuerpos. Las reacciones en geles fueron utilizadas primero para estudios inmunoquímicos a mediados de la década de 1940, cuando Oudin introdujo la inmunodifusión “simple” en una dimensión en tubos conteniendo gel de agar. El demostró que un sistema sencillo Ag-Ac daba lugar a una banda de precipitina y que la mezcla de sistemas en el mismo tubo daba bandas múltiples e independientes. Con estas observaciones, las reacciones de precipitina se desarrollaron tanto cualitativas como cuantitativas. (Siachoque, H. O., 2006) Los precipitados inmunológicos son complejos insolubles formados por la unión de anticuerpos (precipitinas) y antígenos (precipitinógenos) que se encuentran en solución. Para la formación de una malla de precipitado se requiere que tanto las precipitinas como los precipitinógenos sean al menos bivalentes. Esta reacción tiende a ocurrir más rápido con el aumento de la temperatura, aunque la precipitación más completa es obtenida usualmente a temperaturas bajas (0-4oC). Está determinada por el fenómeno de zona, lo cual quiere decir que la máxima precipitación ocurre en un punto o zona de equivalencia que para poder ser visible es necesario determinar las proporciones óptimas de los reactivos. (Siachoque, H. O., 2006) La precipitación de los complejos antígeno-anticuerpo en solución, ha sido utilizada desde 1920 para la cuantificación de antígenos y anticuerpos. Las reacciones en geles fueron utilizadas primero para estudios inmunoquímicos a mediados de la década de 1940, cuando Oudin introdujo la inmunodifusión “simple” en una dimensión en tubos conteniendo gel de agar. El demostró que un sistema sencillo Ag-Ac daba lugar a una banda de precipitina y que la mezcla de sistemas en el mismo tubo daba bandas múltiples e independientes. Con estas observaciones, las reacciones de precipitina se desarrollaron tanto cualitativas como cuantitativas. Los métodos en gel tienen significativamente mayor sensibilidad y mayor poder de resolución que las técnicas sin medio de soporte. Además, los geles actuales pueden ser fotografiados y almacenados, ya que los inmunoprecipitados insolubles que se forman en la zona de equivalencia, son atrapados permanentemente en la matriz del gel. (Siachoque, H. O., 2006) Todas las reacciones de precipitación están basadas en los mismos principios físico-químicos.

Figura 1. Reacción de precipitación en medio líquido

Los aspectos básicos de exceso y de equivalencia de antígeno o anticuerpo son de particular importancia; de hecho, la relativa solubilidad de los complejos con un exceso significativo de cualquiera de los reactantes y la insolubilidad de los mismos en la zona cercana a la equivalencia (proporciones óptimas), son críticos para el proceso de visualización. La reacción de precipitación tiene base en la reacción fundamental antígeno-anticuerpo in vivo, ya que la formación de este complejo es el primer paso en la remoción de agentes infecciosos del cuerpo por el sistema inmune. Estos complejos forman precipitados que pueden ser depurados por diversos mecanismos. (Salvador, M. D. C. O., 2008) Características de los anticuerpos: Los anticuerpos son producidos contra una pequeña molécula específica, química y físicamente definida, que el huésped reconoce como extraña y que se denomina antígeno o determinante antigénico. Los antígenos pueden formar parte de la estructura del patógeno o ser sustancias producidas y liberadas por él. (Salvador, M. D. C. O., 2008) Un microorganismo patógeno contiene y produce muchos antígenos diferentes que el huésped reconocerá como extraños, de modo que la infección con un agente provocará la aparición de varios anticuerpos específicos diferentes. Esta especificidad es la base de la mayoría de las técnicas inmunológicas para detección de Ag o Ac:

Figura 2. Complejo antígeno-anticuerpo

Pruebas de precipitación: También pueden utilizarse Ag solubles que, en contraste con las pruebas de Aglutinación, que utilizan Ag particulados, al interactuar con sus Ac específicos formarán un precipitado o concentración de pequeñas partículas. (Salvador, M. D. C. O., 2008) Objetivo general ● Reconocer el momento justo en el que se ve alcanzado el punto de equivalencia entre el antígeno-anticuerpo mediante la precipitación en fase líquida a través de la realización de diluciones al doble para la obtención de un mayor número de anticuerpos. Objetivos específicos ● Analizar los resultados obtenidos interpretarlos de forma correcta.

durante la práctica para poder

● Identificar que tipo de factores llegan afectar a una reacción de precipitación capilar para poder evitarlos y así no tener ninguna dificultad al momento de visualizar la malla molecular. ● Desarrollar la técnica de precipitación capilar para la cuantificación de los anticuerpos presentes en un antisuero específico.

Procedimiento Obtención de las disoluciones de trabajo: 1. Se colocó los tubos de ensayo en la gradilla y numerarse del 1 al 10 2. Se colocó 200 μl de la SSI en cada uno de los tubos de ensayo.

3. Se agregó 200 μl del Suero de conejo al tubo 1, mezclar y tomar 200 μl de la mezcla y agregarlos al tubo 2. 4. Posteriormente hacer los mismo cada de las diluciones hasta el último tubo. Montaje del equipo de precipitación 1.

Con plastilina se formó un bloque sobre un portaobjeto y se marcó del número 1 al 10, sobre la plastilina.

2. Por capilaridad se obtuvo el suero humano normal hasta una tercera parte del tubo capilar. Para evitar su derrame se utilizó el dedo como si se tratara de una pipeta de vidrio normal. 3. Con una servilleta de papel, se limpió el exterior del tubo capilar y por ese mismo lado, se obtuvo el suero de conejo diluido del tubo 1. Importante: NO PERMITAS QUE SE FORMAN UNA BURBUJA ENTRE LOS DOS LÍQUIDOS. Nuevamente se evitó el derrame utilizando el dedo. 4. Se limpió el tubo capilar, y permitió que los dos líquidos se mezclen. Lentamente permitió que los líquidos se movieran por gravedad al centro del capilar. 5. Se colocó el portaobjetos con la plastilina en forma vertical y se insertó el capilar dentro de plastilina. Se realizó lo mismo con cada dilución y se insertó los tubos en el lugar que les corresponda. 6. Se dejó los tubos a temperatura ambiente y estuvo en revisión cada 24 hrs, hasta que se observó un precipitado dentro del tubo. Resultados

1.- Describe la forma, lugar dentro del tubo y cantidad del precipitado en cada tubo de reacción. En la figura 6 se observa que el capilar 1 tiene una burbuja de aire entre el suero humano y el suero de conejo, por este motivo no se formó precipitado, en la figura 3 se puede observar una representación más detallada.

Figura 3. Representación y distribución de la reacción antígeno-anticuerpo del tubo capilar 1 (ver fig. 6)

Figura 4. Representación y distribución de la reacción antígeno-anticuerpo del tubo capilar 2 (ver fig. 6)

En la figura 6 se observa que el capilar 2 no hay precipitado, lo que indica que posiblemente se encuentre en un estado de equilibrio ambos sueros, en la figura 4 se puede observar una representación más detallada.

En la figura 6 se observa que en los capilares 3 y 4 hay precipitado, representando detalladamente se encuentra en la figura 5.

Figura 5. Representación y distribución de la reacción antígeno-anticuerpo del tubo capilar 3 y 4 (ver fig. 6)

2.- Realiza un esquema de tus tubos y su precipitado o toma una foto y pégala.

Figura 6. Complejo antígeno-anticuerpo

Discusión de resultados 1.- Explica por qué es importante la mezcla correcta de los reactivos

Entre mayor es la disolución mayor es la cantidad de anticuerpos, pero para que esto sea posible las proporciones antígeno anticuerpo deben ser proporcionales ej. 1mg/ml se diluye 1000 veces para llegar al equilibrio ya que ésto hará que exista una respuesta inmunológica efectiva ante el antígeno cuando éste se presente en el individuo 2.- Si hubiera una burbuja entre los reactantes, qué efecto tendría en el experimento. No habría mezcla de sueros por lo tanto la prueba no es correcta y no habrá resultados. 3.- Explica por qué se usan guantes en la manipulación de líquidos de origen humano. Se está haciendo uso de fluidos corporales por lo tanto el uso de guantes es una forma de bioprotección en esta práctica. 4.- Si se obtuvieron resultados diferentes en cada uno de los equipos, discute estas diferencias.

Conclusión En la reacción antígeno-anticuerpo se encuentra el equilibrio cuando existe una cantidad similar entre el Ag y el Ac, pues así interacciona la mayor parte de ambos formando una malla molecular para el precipitado en los tubos capilares. Hay varios factores que afectan en una buena reacción de precipitación capilar como: La temperatura ya que tiene efectos inversamente proporcionales con la constante de equilibrio y la velocidad de reacción. El pH, no existe un pH óptimo por esta razón se debe tener cuidado con este factor para no tener resultados incorrectos. También es importante el tiempo de incubación de nuestra reacción. La concentración Ag-Ac, un exceso de anticuerpo por ejemplo puede inhibir la aglutinación como la precipitación en el efecto prozono de la curva de equivalencia.

Cuestionario 1.- ¿Por qué debemos de hacer diluciones de nuestra muestra problema?

Para estimar de manera semicuantitativa la cantidad relativa de anticuerpos contra un determinado antígeno en un individuo. Además de que a mayor concentración de anticuerpos en la muestra, mayor será la dilución capaz de dar una reacción positiva a la prueba.

Figura 7. Ejemplo, el suero 2 posee mayor cantidad de anticuerpos contra el antígeno que se probó, en comparación con el suero 1, ya que aún diluyéndolo 1:128 fue capaz de dar una reacción positiva, mientras que el suero 1 alcanzó a dar positivo hasta una dilución máxima de 1:16.

(Lamonte, 2007). 2.- Según los resultados de todos los equipos , que significan tantos resultados diferentes. La cantidad de precipitado varía según la proporción de los reactivos, así mismo la concentración y temperatura. También hay que tener en cuenta si se homogeneizó bien la mezcla de antígeno-anticuerpo. 3.- Investiga si se puede acelerar la reacción antígeno-anticuerpo , como y el porqué. Modificando la concentración del antígeno-anticuerpo, ya que el exceso de anticuerpo puede llegar a inhibir la reacción. También al incrementar la temperatura la velocidad de reacción será mayor. (Bautista, 2004) 4.- Realiza el flujograma de la práctica del día de hoy.

Figura 8. Procedimiento para la obtención de las disoluciones a trabajar.

Figura 9. Montaje del equipo de precipitación.

Referencias

● Bautista, J. (2004). Factores que intervienen en la reacción antígeno-anticuerpo. Medigraphic. Recuperado el 21 de abril de 2021 de sitio web: https://www.medigraphic.com/pdfs/gaceta/gm-2004/gms043h.pdf ● Lamonte, B. (2007). Manual de métodos inmunológicos. Recuperado el 20 de abril de 2021 de sitio web: http://www.kerwa.ucr.ac.cr/bitstream/handle/10669/9244/2007_Manual _Metodos_Inmunologicos_completo_web.pdf?sequence=1&isAllowed=y ● Siachoque, H. O. (2006). Inmunología. Diagnóstico e interpretación de pruebas de laboratorio. Universidad del Rosario. ● Salvador, M. D. C. O. (2008). MANUAL DE PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DE INMUNOLOGÍA APLICADA (Doctoral dissertation, INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL)....