Labo s Practicum PDF

Preview

Summary

Download Labo s Practicum PDF

Description

FACULTEIT BIO-INGENIEURSWETENSCHAPPEN

BIOCHEMIE: PRAKTISCHE OEFENINGEN

dr. ir. V. Maervoet 2013-2014

Laborichtlijnen Algemeen   

   

In het labo wordt er niet gegeten of gedronken. Tassen en jassen worden in het kamertje aan de koude kamer gelegd, niet aan de labotafels Het dragen van een labojas is verplicht. Als je je jas vergeten bent kan je een wegwerplabojas verkrijgen voor 5 €. Deze labojas wordt aan het einde van de les teruggegeven, maar het geld krijg je niet terug Iedere student brengt tevens een spatel, lepel, alcoholstift en handdoek (of vod) mee naar het labo De aanwezigheid van alle studenten is verplicht, afwezigheid is alleen toegestaan mits voorlegging van een doktersbriefje. Het practicum moet dan niet worden ingehaald De aanwezigheid wordt gecontroleerd via een handtekening die gezet wordt aan het einde van het practicum, na controle van de orde en netheid Het verslag bestaat uit de volgende delen: principe, werkwijze, resultaten, besluit, en vragen. Het principe en de werkwijze worden bondig geschreven. Het verslag wordt tegen de volgende maandag op Minerva gepost.

Orde en netheid   

  

Aan het begin en aan het einde van het practicum wordt de labotafel afgekuist met dettol. De gebruikte tissues worden bij het restafval gedaan Voor het verlaten van het lokaal worden de handen gereinigd met 70% ethanol Al het gebruikte glaswerk wordt gereinigd met kraantjeswater (eventueel opgewarmd in de microgolfoven) en nagespoeld met gedestilleerd water. Daarna wordt het glaswerk afgedroogd, indien mogelijk en op zijn plaats teruggezet. De producten kunnen opgezocht worden in de productenmap en teruggevonden worden in de glas- , koel- , brand- , zuur- en basekasten. Na gebruik worden ze op hun plaats teruggezet Voor het werken met zuren en basen dienen handschoenen gedragen te worden en een veiligheidsbril opgezet. Deze zijn in het labo voorradig. Het afval dient in de daartoe voorziene vaten gesorteerd te worden: restafval, glas, gecontamineerd plastiek, zuren, basen, solventen,..

Vragen of opmerkingen [email protected]

Theoretische informatie Verdunningen maken Indien vermeld staat dat je een bepaalde oplossing een aantal keer (vb 6x) moet verdunnen dan bepaal je eerst je eindvolume dat je wilt bekomen, bijvoorbeeld 2 ml. Daarna deel je dit volume door het aantal keer dat je het moet verdunnen (in dit geval dus 6) om te weten hoeveel van de oplossing je moet nemen (2 ml/6 = 0,33 ml) en leng je de rest aan met water of buffer (in dit voorbeeld dus 2 ml – 0,33 ml = 1,67 ml). Een ander voorbeeld: Stel je maakt een stockoplossing waarin je kaliumjodaat oplost in ethanol. Om de werkoplossing te bekomen dien je de stockoplossing 10x te verdunnen. Het gewenste eindvolume is 5 ml. Dus:  

Hoeveelheid stockoplossing: 5 ml/10 = 0,5 ml Hoeveelheid ethanol (in dit voorbeeld is de stockoplossing gemaakt in ethanol, dus dit heb je ook nodig voor de werkoplossing): 5 ml – 0,5 ml = 4,5 ml

Een oplossing maken Indien beschreven staat dat er een oplossing dient gemaakt te worden van 2 % (w/v) (vb glucoseoplossing) dan moet je 2 g van de vaste stof afwegen en oplossen in 100 ml gedestilleerd water. Indien je een 2 % (v/v) oplossing moet maken van een vloeistof (bijvoorbeeld ethanol), dan dien je 2 ml ethanol te mengen met 98 ml gedestilleerd water.

UV/VIS-Spectrofotometrie Inleiding UV/VIS-spectrofotometrie is een analysetechniek waarbij de concentratie van een stof bepaald wordt door de absorptie van zichtbaar of ultraviolet licht te meten. Hiervoor dient men in eerste instantie het absorptiemaximum te bepalen van die stof aan de hand van een absorptiespectrum. Dit spectrum is een patroon van extinctiepieken en –dalen in het golflengtegebied 200-800 nm en vormt een unieke “vingerafdruk” van de molecule. Het spectrum is afhankelijk van het oplosmiddel, de redox-toestand, de aanwezigheid van andere moleculen, de pH en de omgevingstemperatuur omdat de absorptie- en verstrooiingseigenschappen van een molecule afhangen van de structuur, de vorm, de ladingsverdeling en de elektronenconfiguratie van de molecule. Als voorbeeld wordt in Figuur 1 het absorptiespectrum van β-carotenen weergegeven. Het absorptiemaximum wordt hier bereikt bij 440 nm.

Figuur 1: Het absorptiespectrum van β-carotenen

Het absorptiespectrum wordt gemeten met een dubbelstraalspectrofotometer waarbij de lichtbundel in tweeën wordt gesplitst en dus tegelijkertijd door de te meten oplossing en door een referentieoplossing wordt geleid. Deze referentieoplossing is nodig omdat de cuvet, het oplosmiddel en eventueel andere opgeloste stoffen (bijvoorbeeld van een bufferoplossing) ook licht absorberen. De golflengte waarbij de absorptie wordt gemeten verloopt automatisch met een constante snelheid van 800 nm naar 200 nm. Zo worden absorpties geregistreerd in het zichtbare en het UV-gebied. Voor verdere theoretische achtergrond en het principe van een spectrofotometer wordt naar de desbetreffende cursussen verwezen. Eenmaal het absorptiemaximum gekend is van een stof, kan een ijklijn opgesteld worden die nadien gebruikt kan worden voor het bepalen van de concentratie. Hiervoor worden minimum 6 oplossingen met gekende concentraties van de te bepalen stof en een blanco aangemaakt (=standaarden). Een blanco is het oplosmiddel die alle behandelingen ondergaat, maar waaraan geen te bepalen stof is toegevoegd. De gemeten absorbanties worden uitgezet in een grafiek tov de 1

standaarden (spreidingsdiagram in Excel). Er wordt gecontroleerd of de absorbantie van de ijkconcentraties voldoende gespreid zijn. Zo niet, worden andere verdunningen gemeten. De best passende rechte (trendlijn) wordt dan geconstrueerd en de vergelijking van de rechte met de correlatiecoëfficiënt bepaald. In het voorbeeld van de β-carotenen zal de ijklijn opgesteld worden bij een golflengte van 440 nm. Meten we dan 7 concentraties tussen 0 en 0,1 mg/ml, dan kan een grafiek bekomen worden zoals in Figuur 2. De vergelijking van de bestpassende rechte is in dit geval “Absorbantie=11,366*Concentratie+0,014” en de correlatiecoëfficiënt 0,99.

1.4

Absorbantie

1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

Concentratie (mg/ml) Figuur 2: Ijklijn van β-carotenen gemeten bij 440 nm

Tot slot wordt de onbekende concentratie uit de grafiek afgelezen indien de absorbantie gekend is. Deze waarde moet gelegen zijn binnen het rijkgebied van de standaarden. Indien de absorbantie buiten deze van de ijklijn valt, moeten ofwel betere standaarden gekozen worden, ofwel moet de onbekende op voorhand verdund worden. Verdunnen na een kleurreactie geeft dikwijls aanleiding tot foutieve resultaten omdat het keurreagens niet in voldoende overmaat aanwezig is. Stel dat in ons voorbeeld een staal met een onbekende concentratie wordt gemeten en de absorbantie is 0,65, dan kan met behulp van de vergelijking berekend worden dat het staal een concentratie heeft van 0,056 mg/ml.

Doel van de proef Het doel van deze proef is het opstellen van een absorptiespectrum voor 3 verschillende stoffen, waarna een ijklijn opgesteld wordt voor één van de stoffen en de concentratie bepaald wordt van een onbekend product.

2

Werkwijze Absorptiespectra Drie interessante stoffen dienen onderzocht te worden. Hieronder kunnen we moleculen onderzoeken die een gekleurde oplossing geven (dus met absorptiepieken in het zichtbaar gebied) en stoffen die geen gekleurde oplossingen geven (met absorptiepieken in het UV-gebied). Indien er gemeten wordt in het zichtbaar licht, wordt er gebruik gemaakt van 1,5 ml cuvetten met een werkvolume van 1 ml. In het UV-gebied maakt men gebruik van kwartscuvetten met een werkvolume van 3 ml, voor deze stoffen is er dus een groter volume vereist. OPGELET: Kwartscuvetten zijn zeer duur (65 €/stuk) en dienen dan ook met uiterste voorzichtigheid behandeld te worden. De stoffen die iedereen dient te onderzoeken zijn:  

Vitamine B12: concentratie van 0,1 mg/ml, opgelost in gedestilleerd water; golflengte 200650 nm Appelsap: onverdund; golflengte 200-600 nm. Dit appelsap wordt gemeten tov een lege cuvet. Om het effect van de pH op het absorptiespectrum te bestuderen, wordt het spectrum eens bepaald bij pH 3,5 (de pH van appelsap zelf) en eens bij pH 10.

Daarnaast kan er nog een keuze gemaakt worden uit volgende moleculen: Hemoglobine: een oplossing met een concentratie van 3 mg/ml (opgelost in gedestilleerd water) dient verwarmd te worden bij 40°C gedurende 10-15 min en nadien gefiltreerd en 3x verdund; golflengte 200-800 nm.  NADH: concentratie 0,1 mg/ml; golflengte 200-450 nm; gebruik hiervoor kwartscuvetten  Methyleenblauw: concentratie van 0,025 mg/ml, opgelost in gedestilleerd water; golflengte 400-800 nm  Bovine Serum Albumine: concentratie 1 mg/ml; golflengte 200-450 nm; gebruik hiervoor kwartscuvetten 

Ijklijn en bepalen van een onbekende concentratie Er wordt een ijklijn opgesteld van vitamine B12 met als hoogste concentratie 0,07 mg/ml. De overige standaarden worden bekomen door ofwel de hoogste concentratie te verdunnen ofwel door steeds opnieuw een hoeveelheid af te wegen en op te lossen. De verschillende standaarden en het onbekende staal worden gemeten met de spectrofotometer, waarna de standaarden worden uitgezet in een grafiek (dus ook de blanco telt als meetwaarde) en de best passende rechte bepaald wordt. Uit de vergelijking van deze rechte kan dan de concentratie van het onbekende staal berekend worden.

Verslag   

Geef de absorptiespectra van de 5 stoffen en hun pieken Geef de ijklijn van vitamine B12, de bestpassende rechte met vergelijking en de correlatiecoëfficiënt Bepaal de concentratie van het onbekende staal 3



Vragen: o Geef de structuurformule van NADH en vitamine B12 o Welk effect heeft de pH op het absorptiespectrum van appelsap? o Wat is de functie van hemoglobine in ons lichaam en welke rol speelt dit eiwit bij COvergiftiging? o Bij welke golflengte heb je de ijklijn van vitamine B12 opgesteld en waarom? o Wat is de rol van vitamine B12 in ons lichaam?

4

Bepaling van Vitamine C Inleiding Vitamine C of ascorbinezuur (Figuur 3) is een chemische stof die levensnoodzakelijk is, maar die niet kan aangemaakt worden door de mens en dus in het dieet of het voedingsmilieu moet voorkomen. Hoewel dit vitamine nog geen halve eeuw geleden als chemische verbinding werd ontdekt, zijn de gevolgen van een gebrek aan dit bestanddeel in ons voedsel al sinds de oudheid bekend. Reeds door de Egyptenaren werden de symptomen van scheurbuik beschreven: grote vermoeidheid (zelfs bij lichte inspanningen), reumatische klachten, tandvleesbloedingen, en onderhuidse en inwendige bloedingen (bv in de gewrichten) in het beginstadium; degeneratie van het tandvlees en uitvallen van de tanden in een latere periode; en een dodelijke afloop.

Figuur 3: Vitamine C of ascorbinezuur

Vitamine C is een elektronendonor. Zo wordt bijvoorbeeld Fe3+ tot Fe2+, de metabolisch actieve vorm van ijzer, gereduceerd. Verder activeert het ook het vitamine foliumzuur tot de werkzame vorm tetrahydrofoliumzuur (THF) door reductie. Vermits zowel Fe2+ als THF nodig zijn voor de synthese van hemoglobine, is ascorbinezuur dus indirect betrokken bij de productie van erytrocyten. Daarnaast is het ook een elektronendonor voor verscheidene enzymen bij de mens, waaronder een hydroxylase die proline omzet in hydroxyproline, aanwezig in collageen, een voorbeeld is. Vermits collageen voorkomt in bind- en steunweefsel zoals kraakbeen, beenweefsel en tandbeen kunnen de symptomen van scheurbuik gelinkt worden aan een tekort aan vitamine C. Ascorbinezuur is tevens een antioxidant omdat door het doneren van zijn elektronen, het verhindert dat andere componenten geoxideerd worden. Zo trekt het heel gemakkelijk O2 aan, waardoor die zuurstof geen andere stoffen meer kan oxideren. Hierdoor verkleuren of bederven voedingsmiddelen minder snel en wordt hun smaak beter bewaard. Het E-nummer van vitamine C is E300. Fruit en groenten zoals bijvoorbeeld kiwi, mango, appelsien, aardbei, broccoli, kolen, spruiten, aardappelen en tomaten, zijn de voornaamste bronnen van vitamine C, hoewel de concentratie aan ascorbinezuur varieert met het oogstseizoen, de transporttijd naar de verkoopplaats, de opslagperiode en het kookproces. Zo bevat rode en groene peper rauw 65 mg vitamine C, terwijl als men ze kookt er slechts 50 mg overblijft. De Belgische aanbevolen dagelijkse hoeveelheid bedraagt 110 mg/dag. Een tekort aan vitamine C is nefast voor de gezondheid (scheurbuik), maar een te grote hoeveelheid is ook niet gezond. Via

5

wetenschappelijk onderzoek is aangetoond dat een teveel aan vitamine C de kans op nierstenen vergroot en dat deze kans groter is bij mannen dan bij vrouwen. Voor de bepaling van vitamine C in groenten, fruit, geneesmiddelen,… wordt gebruik gemaakt van 2,6-dichlorofenolindofenol (DCPI). Deze molecule kleurt blauw in een basisch milieu en roze in een zure omgeving. Deze kleurstof zet ascorbinezuur om in dehydro-ascorbinezuur, terwijl het zelf gereduceerd wordt tot een kleurloze component (zie Figuur 4). Hierdoor kan het eindpunt van de reactie (en dus ook van de titratie) waargenomen worden door de eigen kleur van het 2,6dichlorofenolindofenol: Op het moment dat alle vitamine C omgezet is naar dehydro-ascorbinezuur, zal de oplossing roze kleuren (er wordt gewerkt in een zuur milieu).

Figuur 4: Reactieschema van de reductie van 2,6-dichlorofenolindofenol door vitamine C

Doel van de proef Het doel van deze proef is het bepalen van de hoeveelheid vitamine C in 5 verschillende groenten en/of fruit.

Werkwijze De concentratie aan vitamine C wordt als volgt bepaald:       

 

Pers het stuk fruit (kiwi, appelsien, pompelmoes, citroen,…) uit. Verdun 3 ml van dit sap 10x met 2 % oxaalzuuroplossing Pipetteer van deze oplossing 10 ml in een erlenmeyer Voeg hieraan 2 ml geconcentreerd azijnzuur Maak 250 ml van 0,001 N (=0,0005 M) 2,6-dichlorofenolindofenol (268,095 g/mol) Giet deze oplossing in de buret en lees het volume af Titreer nu het 2,6-dichlorofenolindofenol bij de te onderzoeken stof tot er een roze kleur ontstaat. OPGELET: Na iedere toevoeging moet je licht zwenken, maar niet te hard schudden! Lees het volume in de buret opnieuw af Het verbruikte volume = T 6

  

 

Deze titratie wordt herhaald met 10 ml 2 % oxaalzuuroplossing waaraan 2 ml azijnzuur is toegevoegd (dus zonder het sap van het stuk fruit). Dit is de blanco-bepaling Het verbruikte volume bij de titratie van de blanco-bepaling = B Tot slot wordt 10 ml ascorbinezuurstandaard getitreerd: o Los 2 mg ascorbinezuur op in 100 ml 2 % oxaalzuuroplossing o Breng 10 ml over in een nieuwe beker/erlenmeyer o Voeg 2 ml azijnzuur toe o Titreer De titer bekomen met de ascorbinezuurstandaard = S Herhaal de titratie van het sap, de blanco en de standaard

Het vitaminegehalte van het testmonster wordt als volgt berekend:

Verslag  

Bepaal de concentratie vitamine C in het fruit en vergelijk jouw uitkomst met de literatuur Vragen: o Wat is een vitamine? o Van waar komt de naam ascorbinezuur? o Is vitamine C een vetoplosbaar of wateroplosbaar vitamine? Geef nog 3 voorbeelden van andere vitamines uit dezelfde groep o Waarom titreert men met een ascorbinezuurstandaard? o Geef twee voorbeelden van andere methodes om vitamine C te bepalen

7

Bepaling van de glucoseconcentratie in sportdranken Inleiding Sportdranken bestaan al meer dan 35 jaar en zijn in eerste instantie ontwikkeld om de sportprestatie te verbeteren, maar tegenwoordig worden ze meer en meer gedronken als gewone dorstlesser. Sportdranken bestaan uit water, koolhydraten en elektrolyten, eventueel aangevuld met taurine of cafeïne. Ze hebben twee doelen, namelijk het aanvullen van vocht in het lichaam waardoor de vochtbalans wordt hersteld of in stand wordt gehouden, en het aanvullen van energie in de vorm van koolhydraten. Er zijn 3 soorten sportdranken: hypotone, isotone en hypertone dranken. Deze indeling wordt gemaakt in functie van hun osmolariteit, zijnde de concentratie aan opgeloste deeltjes zoals koolhydraten en zouten. 





Een hypotone drank, zoals bijvoorbeeld kraantjeswater, bevat minder opgeloste deeltjes dan het bloed. Hierdoor kan deze drank snel de maag passeren, maar eenmaal in de dunne darm gebeurt de vochtuitwisseling langzaam. Bij een isotone drank is het aantal opgeloste deeltjes per liter gelijk aan die in een levende cel van ons lichaam. Hierdoor wordt het gemakkelijk opgenomen door het lichaam. Gemiddeld bevat een isotone sportdrank 6 à 8 g koolhydraten per 100 ml. Een drank die meer opgeloste deeltjes bevat, en dus ook meer dan 8 g koolhydraten per 100 ml, wordt een hypertone drank genoemd. Door deze hoge concentratie blijft de vloeistof langer in de maag en worden de opgeloste deeltjes minder snel opgenomen. Wel kunnen de koolhydraten in deze dranken helpen bij het aanvullen van de energievoorraad tijdens en na het sporten. Daarom worden ze ook wel eens energiedranken genoemd.

Om te bepalen of een drank isotonisch dan wel hypo- of hypertonisch is, kan de glucoseconcentratie bepaald worden met behulp van kaliumpermanganaat. Glucose is een reducerend suiker die zijn elektronen doneert aan het paarse kaliumpermanganaat. Deze laatste wordt hierdoor gereduceerd tot kleurloze mangaanionen. De tijd die nodig is om deze reactie te bewerkstelligen is evenredig met de concentratie glucose. Dus indien een ijklijn wordt opgesteld met een aantal gekende concentraties glucose, dan kan aan de hand van de gemeten tijd bepaald worden hoeveel glucose aanwezig is in de sportdrank.

Doel van de proef In dit practicum dien je te bepalen of twee onbekende sportdranken (A en B) isotoon, hypotoon of hypertoon zijn door het meten van de glucoseconcentratie in de dranken. Aan de hand van de gemeten glucoseconcentraties dient dan achterhaald te worden welke drank Aquarius is.

8

Werkwijze Reagentia Glucosestandaardoplossingen: Maak glucoseoplossingen van 2, 4, 6, 8, 10 en 12 % (w/v) met een eindvolume van 10 ml Zwavelzuur: Verdun de aanwezige zwavelzuur 18x zodat een eindconcentratie van 1 M bekomen wordt. Let op! Doe steeds een zuur bij water en nooit water bij een zuur!! Kaliumpermanganaat: Los 12 mg kaliumpermanganaat op in 30 ml

Procedure Om de glucoseconcentratie van een onbekende drank te bepalen dient eerst een ijklijn opgesteld te worden. Hiervoor dienen alle glucosestandaardoplossingen één voor één behandeld te worden. Nadien kan de glucoseconcentratie bepaald worden in de sportdranken.



Neem een eerste erlenmeyer/beker, bijvoorbeeld met 2 % glucose Voeg aan deze erlenmeyer/beker 5 ml zwavelzuur (1M) en 2 ml kaliumpermanganaat toe terwijl de oplossing wordt geroerd Start de klok onmiddellijk na het toevoegen van de kaliumpermanganaat

 

Van zodra de paarse kleur verdwijnt stop je de klok en noteer je de tijd Doe dit voor alle glucoseoplossingen en de twee sportdranken

 

Zet in een grafiek de tijd uit in functie van de concentratie glucosestandaardoplossing Bereken aan de hand van de grafiek de concentratie glucose in de sportdranken

 

Verslag    

Geef de grafiek van de glucosestandaardoplossingen, de bestpassende trendlijn met vergelijking en de correlatiecoëfficiënt Bepaal de glucoseconcentratie in de sportdranken. Welke is hypertoon? Waarom? Welke drank is Aquarius? A of B? Waarom? Vragen: o De glucoseoplossingen die in dit practicum gebruikt worden zijn gemaakt van α-Dglucose. Waarvoor staat “α”? En waarvoor staat “D”? o Wat is een reducerend suiker? o Werkt deze methode ook met niet-reducerende suikers? Waarom wel of niet? o Wat is taurine en...