Laboratorio 1. Manejo y cultivo de la Drosophila PDF

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LABORATORIO 1 MANEJO Y CULTIVO DE DROSOPHILA (VIRTUAL) Este material se ha facilitado solo para uso de las clases virtuales debido a la pandemia COVID-19. El mismo no se puede reproducir. Oriana I. Batista, M.Sc., Dr.rer. nat. INTRODUCCION En la enseñanza de cualquier ciencia, el trabajo de laboratorio es de gran significado y ayuda en el logro de los objetivos. En genética, por la naturaleza misma del objeto de estudio, el laboratorio representa un elemento indispensable en el proceso de aprendizaje. La mosca de la fruta (Drosophila melanogaster), orden Díptera y familia Drosophilidae, ha sido sin duda el organismo más utilizado en la investigación y enseñanza de la genética, desde que fue estudiada por T.H. Morgan. Esto se debe a que presenta una serie de características ventajosas, tales como:1) amplia distribución, lo cual facilita su obtención; 2) reducido número de cromosomas y la presencia de cromosomas gigantes en los tejidos, lo cual facilita la observación citogenética y 3) la existencia de gran variedad de mutantes y la disponibilidad de mapas genéticos. Estas características hacen de la Drosophila un organismo ideal para demostrar las leyes de la herencia. Además de las ventajas enumeradas, D. melanogaster posee un ciclo corto (fig. 1) y una alta fecundidad (caracterizada por grandes tamaños de camada), lo cual permite obtener un gran número de progenie en un período de tiempo relativamente corto. El cuadro 1 muestra las diferentes fases del ciclo de vida de D. melanogaster y la duración de cada una de las fases a diferentes temperaturas. El ciclo de vida comienza con la formación del cigoto, luego de la fertilización. La fase de desarrollo embrionario dura dos días aproximadamente y concluye al emerger las larvas, las cuales se caracterizan por su actividad física. La fase larval concluye con la formación de capullos (pupas) de unos 4 mm de tamaño. De las pupas posteriormente emergen los adultos o imagos.

Cuadro 1. Duración de las distintas etapas del ciclo de vida de la Drosophila melanogaster a dos temperaturas diferentes. Fase

20o C

25o C

Huevo y larva

8 días

5 días

Pupa

6.3 días

4.5 días

Ciclo Completo

15 días

10 días

Los cultivos de D. melanogaster usualmente se mantienen en un ámbito de temperatura entre 20o C y 25o C. A temperatura menores que éstas, la variabilidad de los individuos se reduce significativamente y el ciclo de vida se alarga. A temperaturas mayores que éstas, la fecundidad se reduce y aumenta la proporción de individuos estériles. Otra de las características ventajosas es que sus requerimientos ambientales se adecuan bien

de medios de cultivos con el objeto de hacer más eficiente su manejo y reproducción, manteniéndose libre de contaminación genética, de hongos, etc. Estos medios deben cumplir con los siguientes requerimientos: 1. Deben tener una consistencia firme: que garantice que no se desintegren al manipular las moscas; esto básicamente se logra añadiendo agar (20 gramos por litro). 2. Deben proveer energía y nutrientes en proporciones adecuadas: que garanticen el desarrollo y crecimiento de las larvas; para esto se utiliza azúcar, banano, melaza o sirope. Asimismo, deben representar una fuente de alimento apropiada para los adultos. Para ello se agregan unos cuantos granos de levadura seca activa (la marca Fleishmann da los mejores resultados). 3. Deben tener un volumen adecuado: esto se logra adicionando agua, agar, cereales o mezclas de ellos. 4. Deben ser resistentes a la contaminación por microorganismos. Esto se logra adicionando algún inhibidor de organismos contaminantes indeseables, tales como hongos y bacterias. Al respecto el ácido propiónico produce excelentes resultados.

Fig. 1: Ciclo de vida de la Drosophila melanogaster. (tomado de http://depa.pquim.unam.mx/genetica/ Practica1.htm).

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1. Familiarizar al estudiante con la "mosca de la fruta" (Drosophila melanogaster), su ciclo de vida, su cultivo y manejo en el laboratorio. 2. Brindar información acerca de la utilidad de Drosophila melanogaster como organismo de investigación y enseñanza en genética. MATERIALES _ Mutantes y cultivos silvestres de Drosophila melanogaster. _ Anestesiador y reanestesiador. _ Pincel fino y agujas de disección con mango*. _ Esteroscopio. _ Etiquetas engomadas*. _ Eter*. Los materiales marcados con el símbolo (*) deben ser aportados por el estudiante.

PROCEDIMIENTO I.

Creación de un cultivo en casa

En un frasco de alargado y boca no muy ancha (jugos Gerber, frascos de aceituna) agregue un pedazo de guineo (menos de la mitad) y permita que entren Drosophilas únicamente, luego tápelas con una porción de pantimedias. Esta evitará que escapen, pero permitirá la entrada de oxígeno. II.

Observación de moscas

Tome un cultivo de D. melanogaster e identifique las diferentes fases del ciclo de vida. Diga cuáles observa y descríbalas. Ayúdese con la figura 1. Ponga atención a las características físicas y químicas del medio.

III. Distinción de sexos Siguiendo las instrucciones del punto II, anestesie un grupo de 10 a 20 moscas ( puede usar éter en un algodón o en este caso puede dejar que unas cuantas gotas del éter actúen por un período de tiempo suficiente como para matarlas, trabaje en un área abierta). Colóquelas sobre un papel de filtro o porción de papel blanco y obsérvelas utilizando una lupa. Con ayuda de un pincel fino, separe los machos de las hembras. Los machos se reconocen por tener el extremo del abdomen redondeado, mientras que las hembras lo presentan puntiagudo y se nota la presencia del ovopositor (fig. 2). Una vez que ha incluido la separación de los sexos con base en la forma de los extremos del abdomen, identifique otras diferencias entre ambos sexos haciendo un estudio comparativo de: 1. El número de anillos claros y oscuros que aparecen en la región dorsal del abdomen. 2. La presencia de cerdas en la parte ventral, en el extremo del abdomen, donde se localiza el aparato reproductor. 3

observaciones anteriores usando estos rasgos para separar machos y hembras (fig. 3).

Fig 2: Moscas adultas de Drosophila melanogaster: macho a la izquierda, hembra a la derecha. (Tomado de Demerec, M. Ed., Drosophila guide, 1961, p.7).

Fig 3: Diagrama de la pata anterior del macho de Drosophila melanogaster. Abajo a la derecha, comparación del metatarso de la hembra y del macho. Tomado de Demerec, M. Ed., 1965, Biology of Drosophila).

IV. Estudio y reconocimiento de algunos mutantes de Drosophila. Una de las ventajas que tiene la D. melanogaster como organismo de investigación y enseñanza es, 4

con la ayuda de un estereoscopio. La enorme diversidad de mutantes ha obligado a desarrollar un sistema de nomenclatura que permita reconocerlos. Así, se utiliza un símbolo que está dado por uno o dos rasgos determinados por alelos dominantes y las letras minúsculas representan los rasgos determinados por alelos recesivos. Finalmente, cuando aparece un signo +, este denota el carácter silvestre, generalmente determinado por un alelo dominante. Cuadro 2: Genotipo y características de los mutantes en comparación con la Drosophila silvestre. Nombre del mutante y silvestre

Genotipo

Característica diferente respecto al silvestre

H:XwXw; M:XwY

Ojos blancos Ojos sepia

se/se

Alas vestigiales

vg/vg

Control- Ojos Drosophila silvestre Control- Alas Drosophila

+/+, +/se +/+, +/vg

silvestre LA DROSOPHILA SILVESTRE SE CARACTERIZA POR TENER: OJOS ROJOS, CUERPO AMARILLO CLARO Y ALAS REDONDEADEAS Y LARGAS QUE CUBREN TODO EL ABDOMEN.

A. Identificación de genotipos y fenotipos Use el sistema de nomenclatura descrito y represente ahora el genotipo homocigoto dominante, el homocigoto recesivo, y el heterocigoto para cada uno de los mutantes desconocidos y describa su fenotipo. 1. Busque en internet tres mutantes diferentes. Compárelos con individuos de fenotipo silvestre, y determine la (s) diferencia (s) entre ambos. Haga la descripción tomando en consideración localización, origen, descubridor, sinónimos y fenotipo, tal como aparece abajo en la sección de marcadores genéticos. 2. Repita este procedimiento con todos los mutantes. 3. En el cuadro dos escriba toda la información obtenida para cada uno de los mutantes.

OBSERVACIONES LABORATORIO

IMPORTANTES

CUANDO

SE

UTILIZAN

CULTIVOS

DE

1. No destape el cultivo sin guardar las medidas necesarias para evitar que las moscas Drosophila escapen de los cultivos. 2. Al trasladar las moscas de un cultivo a otro, no golpeé el frasco por el fondo, hágalo por los 5

3. Cuando pase moscas anestesiadas a un cultivo nuevo mantenga el frasco en posición horizontal, para que no se peguen en el fondo. 4. Al anestesiar las moscas, observe atentamente el momento en que ellas caen al fondo del anestesiador afectadas por el éter; las exposiciones prolongadas o las dosis fuertes pueden causar su muerte. 5. Si no está seguro acerca de la identificación de algún individuo, consulte a su instructor. 6. Deseche en la MORGUE el sobrante de las moscas anestesiadas, para evitar que vayan a contaminar otros cultivos. 7. Cada vez que va a trabajar con un cultivo nuevo debe asegurarse que el anestesiador y los otros instrumentos estén totalmente limpios. 8. Cuídese de no añadir un exceso de levadura al medio porque daña el cultivo. 9. Es importante que Usted haga dibujos comparativos de las moscas de ambos sexos, así como también de las mutantes. 10. Haga un cuadro con todos los rasgos estudiados.

Marcadores genéticos de Drosophila melanogaster A continuación se enlistan algunos ejemplos de mutantes y sus descripciones en orden alfabético de acuerdo con el siguiente formato. símbolo: nombre Localización: la localización se indica por el número del cromosoma, separando con un guión la ubicación genética en el cromosoma. Origen: para los mutantes inducidos se da el nombre del agente, los mutantes recuperados de progenitores no tratados o encontrados en poblaciones silvestres se indican como espontáneos. Descubridor: se da el nombre del descubridor y la fecha. Sinónimos: se indican símbolos o nombres alternativos con los que se conoce el mismo gen; en la mayoría de los casos se trata de nomenclatura obsoleta. Fenotipo: se indican las características más importantes que le distinguen del tipo silvestre, las cuales han servido para sugerir el nombre del gen, como fueron descritas originalmente. La clasificación RK1, RK2, RK3 se refieren a la facilidad para identificar al marcador y para mantener a las moscas portadoras en relación con su viabilidad y fertilidad. Así, una mutación RK1 es evidente en su expresión fenotípica, viable y fértil, mientras que una RK3 puede confundirse con la expresión de tipo silvestre, ser poco viable o poco fértil.

Marcadores genéticos: (Alelo utilizado para conocer un genotipo particular). dp: dumpy (alas truncadas) Localización: 2-13.0 Origen: espontáneo Fenotipo: Los alelos de dp producen tres fenotipos generales: alas oblicuas (o), vórtices en tórax (v) y letal (l). Algunos alelos específicos pueden tener uno, dos o todos estos fenotipos. Por ejemplo: 6

es letal; y dpovl (ovl) tiene los tres atributos. Las tres características recesivas o,l y v se complementan una con otra. Los tres alelos del locus dp son pseudoalélicos.

se: sepia Localización:3-26.0 Descubrió: Wallace Fenotipo: al eclosionar el color del ojo es café oscureciéndose a sepia y haciéndose negro con la edad. La pigmentación de los ocelos es normal. Cromatográficamente los ojos se caracterizan porque no tienen pigmento rojo y una acumulación del pigmento amarillo, sepiapterina; otras pteridinas están presentes en cantidades mayores a lo normal. Los heterocigotos +/se pueden distinguirse de +/+ porque los primeros tienen más isoxanthopterina y otras pteridinas pálidas; las drosopterinas rojas están en el mismo nivel que en moscas del tipo silvestre, de tal forma que el gen se se comporta, como totalmente recesivo en observación visual ordinaria. El color del ojo es autónomo cuando se transplantan discos imagales de larvas en larvas hospederas de tipo silvestre. RK1. vg: vestigial Localización: 2.-67.0 Origen: espontáneo Descubrió: Morgan Fenotipo: alas reducidas a vestigios; por lo general dispuestas en ángulo recto respecto al cuerpo. Las venas de las alas ligeramente visibles. Halterios también reducidos. w: white Localización:1-1.5 Origen:espontáneo Descubrió: Morgan Fenotipo: ojos color blanco. Los ocelos, la cubierta de los testículos del adulto y los tubos de Malpighi de las larvas son incoloros. La isoxantopterina se presenta en cantidades considerables durante el estadio de pupa, pero se elimina durante los primeros 3 días de vida del adulto. El meconio contiene más pteridina que el tipo silvestre. El desarrollo de color del ojo es autónomo en disco ópticos de larvas transplantados en hospederos de tipo silvestre. RK1. Primer mutante encontrado en Drosophila: Miembro de una serie pseudoalélica que contiene cinco subloci.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS Ramos P. y colaboradores. 1993. Manual Drosophila melanogaster. Sidelki P. y colaboradores. Biochemical genetic.

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