Microbiologia - Introduccion de los medios de cultivo y la esterilizacion PDF

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Introduccion de los medios de cultivo y la esterilizacion...

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INTRODUCCIÓN Un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes que permite el desarrollo de microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias. Los microorganismos son los seres más abundantes de la tierra, pueden vivir en condiciones extremas de pH, temperatura y tensión de oxígeno, colonizando una amplia diversidad de nichos ecológicos. Entre los requerimientos más importantes para su desarrollo están el carbono, el oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono e hidrógeno. Muchas bacterias sin embargo necesitan del aporte extra de factores de crecimiento específicos en forma de suero, sangre y extracto de levadura entre otros. Clasificación de los medios de cultivo Según su origen: a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.

b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cualitativa y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.

c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

Según su consistencia a) LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución acuosa. b) SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio líquido (caldo) a razón de 15g/litro. El agar es una sustancia inerte polisacárida (hidrato de carbono) que se extrae de las algas. Como esta sustancia no es digerida por las bacterias no constituye ningún elemento nutritivo. Este conjunto convenientemente esterilizado puede ser vertido en placas de Petri o en tubos de ensayo y presentan la posibilidad de aislar y

diferenciar bacterias, "procesos que antes no eran posibles en medio líquido". c) SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para determinar la motilidad de las especies en estudio. Actualmente se encuentran disponibles comercialmente con el agregado de agar. Según su composición: A causa de los requerimientos químicos del mundo microbiano, a veces es necesario agregar o eliminar componentes químicos del medio. a) COMUNES O UNIVERSALES: su finalidad es el crecimiento de la mayor parte de los microorganismos poco existentes. Es el medio más frecuentemente utilizado para mantener colonias microbianas. Por ejemlo: agar común o caldo común. b) ENRIQUECIDOS: están compuestos de un medio base como apoyo del crecimiento al cual se le puede agregar un gran exceso de nutrientes como suplementos nutritivos, por ejemplo: sangre, suero, líquido ascítico, etc. Se utiliza para microorganismos que tienen grandes exigencias nutricionales. c) SELECTIVOS: son sólidos en los que la selectividad se consigue alterando las

condiciones físicas del medio o añadiendo o suprimiendo componentes químicos específicos con el fin de inhibir el crecimiento de especies químicas cuyo crecimiento no interesa. Este tipo de medio sólo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibiendo el de otros. Se utiliza para seleccionar y aislar microorganismos a partir de poblaciones mixtas. Por ejemplo Agar salado-manitol o Chapman (permite el crecimiento de ciertos estafilococos).

Entre los factores selectivos que alteran las condiciones del medio tenemos: 

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Cambio de pH: por ejemplo agregando ácido acético para favorecer el crecimiento de Lactobacillus (pH final: 5,4 que es hostil par la mayoría de las especies que crecen entre 6,5 y 7,2). Los hongos crecen entre pH 4 y 6 y S. faecalis a pH 9,6.  Cambio de temperatura: la mayoría de las bacterias crece óptimamente entre 20º C y 40º C.

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Los cultivos típicos de S. Faecalis requieren 60º C de temperatura y los de Listeria son capaces de desarrollarse y crecer a 4º C. Alteraciones osmóticas: se acrecientan las propiedades osmóticas un medio con el agregado de cloruro de sodio. Estos medios intensifican la selección de bacterias halófilas como Staphylococcus spp. (7,5%).  Ajuste en la tensión de oxígeno: es importante en la selección de aerobios y anaerobios. 

Ajuste en la tensión de anhídrido carbónico: muchos patógenos importantes pueden ser cultivados a menos que se eleve la tensión más allá de la atmosférica. Para el estudio de los microorganismos es indispensable contar entre otras cosas con material y medios de cultivo estériles. En microbiología la esterilización se define como “el proceso mediante el cual se eliminan todos los microorganismos (incluyendo formas de resistencia) de un objeto, medio o superficie” y su aplicación garantiza la ausencia de microorganismos en el material y medios de cultivo a ser

empleados. Existen diversos métodos de esterilización, entre ellos: calor (seco o húmedo), filtración (para sustancias termolábiles y aire), radiaciones y aplicación de gas de óxido de etileno (para jeringas y cajas de plástico). Un medio de cultivo está constituido por una mezcla de agua y sustancias orgánicas e inorgánicas, los que en conjunto proporcionan los requerimientos nutricionales para el desarrollo de los microorganismos. La composición de los medios de cultivo varía en función de: a) grupo microbiano que se pretende estudiar b) complejidad químico c) estado físico d) aplicación.

A continuación se da una idea general sobre algunos de los constituyentes habituales de los medios de cultivo. AGAR. Se utiliza como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. En el agar bacteriológico el componente dominante es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas y que presenta la indudable ventaja de que a excepción de algunos microorganismos marinos, no es utilizado como nutriente. Un gel de agar al 1-2% se licua alrededor de los 100ºC y se gelifica alrededor de los 40ºC, dependiendo de su grado de pureza. 

EXTRACTOS.

Su preparación consiste en que ciertos órganos o tejidos animales o vegetales (p.e. carne, hígado, cerebro, semillas, etc.) son extraídos con agua y calor y posteriormente concentrados hasta la forma final de pasta o polvo. Estos preparados deshidratados son a menudo empleados en la elaboración de los medios de cultivo. Los más utilizados son el extracto de carne, de levadura y el de malta.

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PEPTONAS.

Son mezclas complejas de compuestos orgánicos, nitrogenados y sales minerales, que se obtienen por digestión enzimática o química de proteínas animales o vegetales (soja caseína carne, etc.). Las peptonas son muy ricas en pépticos y aminoácidos, pero pueden ser deficientes en determinadas vitaminas y sales minerales. 

FLUIDOS CORPORALES.

Con frecuencia es necesario añadir a los medios de cultivo de algunos patógenos sustancias como sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo, sobre todo para conseguir el primer aislamiento a partir del hospedador. La sangre no puede ser esterilizada, y por tanto debe de ser obtenida en condiciones asépticas directamente de un animal sano, y adicionada al medio de cultivo después de que este haya sido auto clavado. Los fluidos corporales no solo aportan factores de crecimiento sino que también aportan sustancias que neutralizan a inhibidores del crecimiento de algunas bacterias. Un ejemplo podría ser la catalasa presente en las células sanguíneas destruye el peróxido de hidrógeno que algunas bacterias que no poseen este enzima acumulan como producto del metabolismo del oxígeno.

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SISTEMAS AMORTIGUADORES.

Para mantener el pH dentro del rango optimo del crecimiento bacteriano a veces, es necesario añadir algunos componentes al medio de cultivo. Debido a que la mayoría de as bacterias son neutrófilas, se suelen emplear sales del tipo de los fosfatos bisodicos ò bipotásicos u otras sustancias como las peptonas para prevenir la desviación del pH. 

INDICADORES DE PH.

Con el objeto de poder detectar variaciones en el pH debido a fermentaciones u otros procesos, se hace necesario a veces añadir indicadores acido-base que nos lo indiquen.

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AGENTES REDUCTORES.

Con el objetivo de crear en los medios de cultivo condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerofilos ò anaerobios se añaden estos agentes reductores siendo, los mas empleados la cisteina y el tioglicolato entre otros. 

AGENTES SELECTIVOS.

La adición de determinadas sustancias a un medio de cultivo puede convertirlo en selectivo. Así, por ejemplo, la adición de cristal violeta, sales biliares, azida sodica, telurito potasico, antibióticos, etc., a la concentración adecuada hará que actúen como agentes selectivos frene a determinados microorganismos.

OBJETIVOS GENERAL Se pretende conocer las diferentes clasificaciones de los medios de cultivo y conocer la manera de realizar estos correctamente. HIPÓTEIS 

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Explicar el concepto de esterilización y su utilidad en microbiología. Aplicar algunas metodologías para esterilizar material y medios de cultivo. Explicar el concepto de medio de cultivo en microbiología. Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los microorganismos in vitro. Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el laboratorio de microbiología. Aplicar algunas metodologías para esterilizar material y medios de cultivo

METODOLOGÍA Un medio de cultivo está constituido por una mezcla de agua y sustancias que en conjunto proporcionan los requerimientos nutricionales para el desarrollo de los microorganismos. La composición de los medios de cultivo varía en función del grupo microbiano que se pretende estudiar, y la preparación del medio depende de la complejidad química (composición), el estado físico y otras condiciones requeridas (pH, concentración, etc.). Existen medios de cultivo comerciales empleados para el desarrollo de los microorganismos más comunes, sin embargo en muchas ocasiones se requiere preparar el mismo mediante la mezcla de sus componentes. Preparación de medios: 1. Leer las indicaciones de la etiqueta del medio de cultivo que se desea preparar. 2. Hacer los cálculos correspondientes en función de la cantidad de medio que se desea preparar. 3. Pesar la cantidad exacta en base a los cálculos en una charola de aluminio o papel con ayuda de la balanza granataria (verificar que este nivelada). Agrega la cantidad a un matraz Erlenmeyer.

4. Medir exactamente el agua a utilizarse de acuerdo a los cálculos realizados en una probeta. 5. Añadir el agua al medio y agitar vigorosamente. 6. Someter el matraz a calentamiento hasta la aparición de burbujas, retirarlo manteniendo agitación continua utilizando un guante de asbesto. 7. Continuar el calentamiento cuidadosamente, hasta que el medio se vea homogéneo sin partículas visibles. Tapar con tapón de algodón con gasa. 8. Colocar dentro del autoclave.

9. Esterilizar a 15 lb de presión por 20 min 10.Una vez concluido el tiempo de esterilización, esperar a que descienda la presión y la temperatura. 11. Sacar del autoclave, dejar enfriar hasta unos 50ºC 12.Con ayuda del guante, hacer el vaciado correspondiente de medio de cultivo a las cajas de Petri, aproximadamente 10 mL, de acuerdo a las instrucciones por parte del docente 13.Una vez que el medio haya solidificado, tapar y someter a incubación con la tapa hacia abajo. 14.Verificar a las 24 h y desechar contaminadas.

REFERENCIAS: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/P2.MediosCultivoEsterilizacion_20891.pdf http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp4.pdf...