MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA Y MORFOLOGÍA COLONIAL PDF

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En esta práctica se realizaron diferentes técnicas de siembra para clasificar los medios de cultivo según su utilidad y selectividad, así como diferenciarlos según sus características físicas. También realizamos las distintas técnicas de siembra para cada tipo de medio y determinaremos el número rel...

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FISIOLOGÍ A

PRÁCTICA 5: MEDIOS DE CULTIVO,

BACTERIA

SIEMBRA Y MORFOLOGÍA COLONIAL

NA

INTRODUCCIÓN: En esta práctica se realizaron diferentes técnicas de siembra para clasificar los medios de cultivo según su utilidad y selectividad, así como diferenciarlos según sus características físicas. También realizamos las distintas técnicas de siembra para cada tipo de medio y determinaremos el número relativo de bacterias en un cultivo solido inoculando con la técnica de aislamiento en cultivo puro. En los estudios microbiológicos, es necesario crear el ambiente ideal “in vitro” para lograr el crecimiento bacteriano que deseamos, para eso es necesario conocer las características que requiere una bacteria para reproducirse idealmente (como ejemplo la temperatura, humedad, presión, pH adecuado, nutrientes y fuente de carbono y nitrógeno), y con el medio de cultivo correspondiente, proporcionarle este ambiente. Los medios de cultivo también sirven para lograr identificar una bacteria desconocida, a partir de las características del medio. Estos pueden ser líquidos, semisólidos o sólidos. Los medios líquidos son preparados en tubos de ensaye, y se inocula con pipeta, hisopo o asa. Se utiliza mayormente cuando no hay abundancia de bacterias en el inoculo y se observa el crecimiento mediante la turbidez. Tiene como ventaja que pueden servir para realizar diluciones. Los medios semisólidos contienen cantidades bajas del agar, también se envasan en tubos de ensaye y solo se siembra picando directamente con el asa recta. El crecimiento se puede observar midiendo la turbidez de la periferia al piquete que se halla hecho con el inoculo. Su consistencia permite que las bacterias móviles no se desplacen y las inmóviles, queden en la línea de inoculación. Los medios sólidos, en cambio, son preparados en cajas de petri, botellas o tubos de cultivo. Se utilizan para la conservación de cepas, pruebas de susceptibilidad o aislamientos en cultivo puro. Para la siembra en este tipo de cultivos se utiliza el asa con punta redonda, realizando una estría cruzada, picadura o en masivo. Para comprender los mecanismos de acción de las sustancias inhibitorias en los medios selectivos, utilizamos 2 bacterias en cada medio para, dependiendo su morfología, diferenciarlas y así indicar si el cultivo es selectivo para una u otra bacteria y si no lo es.

COMENTARIOS Y RESULTADOS:

I.

Siembra en medio liquido, semisólido y solido

Siembra realizada por Galvan Sandoval Heidy Mariel: Tabla 1.- SIEMBRA DE E. coli EN MEDIO LÍQUIDO, SÓLIDO Y SEMISOLIDO. Características Líquido Crecimiento adecuado, el medio es turbio Semisólido Buen crecimiento, hay crecimiento en la línea de entrada, aunque también lo hay alrededor irregularmente. Color de la colonia blanca opaca. Sólido Poco crecimiento, color de colonia blanquecino.

(1)

(2) (3) (4) Fotografía (1): crecimiento en medio sólido. Fotografía (2): crecimiento en medio semisólido. Fotografía (3): Crecimiento en medio líquido. Fotografía (4): comparación del crecimiento en los distintos medios de cultivo.

Siembra realizada por Caro Herbert Andrea Lizette Tabla 2.- SIEMBRA DE E. coli EN MEDIO LÍQUIDO, SÓLIDO Y SEMISOLIDO. Características Líquido Correcto crecimiento, al ver la turbidez del medio. Semisólido Crecimiento excelente, hay crecimiento en toda la línea de entrada del asa. En la superficie del agar se muestra crecimiento excelente. Color de la colonia blanca opaca. Sólido Poco crecimiento, de color blanca cafesosa opaca.

(5)

(6)

(7)

Fotografía (5): crecimiento en medio sólido. Fotografía (6): crecimiento en medio semisólido. Fotografía (7): Crecimiento en medio líquido. Fotografía (8): comparación del crecimiento en los distintos medios de cultivo.

(8)

II.

Aislamiento microbiano: Cultivo mixto A Agar nutritivo

Manitol Sal

Forma

*

tamaño

*

Puntiforme Pequeño

Color

Verde blanquecino

Blanco amarillento

Bordes

*

Elevación Superficie Aspecto Luz reflejada Luz transmitida Producción de pigmento consistencia

Cetrimida

Cultivo mixto B MacCon Verde brillante key

XLD

*

Irregular

Circular

* Verde amarillent o

Mediano

Chico

Rosadovioleta

Irregular

Enteros

*

Irregulares

* Rugosa Seco Brillante

Convexa Lisa Húmeda Brillante

* * Húmedo Brillante

Elevada Lisa seco Mate

Transparente

Opaca

Opaca

Opaco

Traslucido

Brillante Traslucid o- opaco

Verde azulado

amarillo

verde

violeta

amarillo

amarillo

S. aureus

Pseudom ona

S. aureus

Pseudo mona

S. aure us

Pseu dom ona

E. col i

Salm onell a

Elevadaconvexa Rugosa seco Mate

E. coli

Sal mon ella

Convexa

E. coli

Sal mon ella

crecimiento

*No se logró observar debido a que no se formaron las colonias por separado.

(A)

(B)

(C)

Cultivo mixto de S. aureus y P. Aeruginosa en diferentes medios. A) Medio de cultivo Agar nutritivo. B) Medio de cultivo Manitol Sal. C) Medio de cultivo Cetrimida.

(A)

(B)

(C)

Cultivo mixto de E. coli y Salmonella typhimurium en dos medios de cultivo. A) Medio de cultivo MacConkey. B) Medio de cultivo XLD. C) Medio de cultivo verde brillante.

DISCUSIÓN: CONCLUSIÓN: Se lograron realizar las diferentes técnicas de siembra para cultivo de bacterias in vitro, así como clasificar los medios de cultivo según el propósito con que se utilizan y conocer algunos de los medios selectivos y diferenciales más usados para comprender las bases de la selectividad de los medios. Aprendimos la importancia del cultivo de bacterias in vitro y enunciamos las condiciones necesarias para el cultivo de las bacterias, nutrientes, pH, temperatura, humedad y atmosfera de incubación. Diferenciamos los medios e cultivo de acuerdo a sus características físicas y sus aplicaciones. En la sesión B, logramos definir los términos indicados en el manual, conocer el mecanismo de acción de las sustancias inhibidoras que se utilizaron en los medios selectivos, así como conocer el fundamento de los mismos. Distinguimos la diferencia de las colonias de Staphylococcus, Pseudomona, Escherichia y Salmonella en los medios selectivos y diferenciales

CUESTIONARIO: Sesión A: 1. Determinar el número relativo de bacterias encontrado en su caja mediante la técnica de aislamiento.

2. Explicar cuál es la importancia en el laboratorio de microbiología de la técnica de aislamiento en cultivo puro. Se le llama aislamiento a la técnica que se utiliza para diseminar la muestra por el cultivo con el fin de que los microorganismos queden lo suficientemente separados en el cultivo sólido para, después de su incubación, lograr cuantificarlas. También sirve para garantizar la pureza del cultivo obtenido. 3. Explicar la importancia médica de las especies bacterianas trabajadas. Una especie de E. coli, llamada E. coli Uropatógena (UPECcausa graves infecciones en el tracto urinario... En las infecciones ascendentes, las bacterias fecales colonizan la uretra y luego se expanden por el tracto urinario a la vejiga, así como a los riñones (pielonefritis). Staphylococcus aureus se considera una bacteria oportunista, causando enfermedades al humano cuando su sistema inmune es más vulnerable. Bajo tales condiciones, el microorganismo es capaz de provocar afecciones en casi cualquier región anatómica, lo cual refleja su amplio bagaje en cuanto a genes de virulencia que lo habilitan para establecerse, reproducirse, sobrevivir y diseminarse en diversas clases de tejidos (7). Debido a su capacidad resistente a la penicilina y a la Meticilina puede matar por insuficiencia cardíaca, debido a una endocarditis. Pseudomona Aeruginosa: Los pacientes con cáncer o laceraciones graves en la piel por quemadura, son sensibles a infecciones con Pseudomona, ya que estas bacterias producen toxinas fuertes y logran atacar el sistema inmune.

S. typhi causa la fiebre tifoidea solo en células hospederas humanas. Sesión B: 1. Mencione las diferencias que existen entre los siguientes medios de cultivo: básico, enriquecido, diferencial, selectivo, de enriquecimiento y de transporte. Cite tres ejemplos de cada tipo de medio. Los medios de cultivo básico (agar nutritivo, caldo nutritivo y agar de soya) son utilizados para el crecimiento de microorganismos nutricionalmente poco exigentes, en cambio, el medio enriquecido (agar sangre, agar chocolate y agar infusión cerebro corazón) promueve el crecimiento de microorganismos con requerimientos nutricionales exigentes. Los medios diferenciales (Agar verde brillante, agar Salmonella Shigella y agar MacConkey) contienen indicadores que permiten diferenciar géneros o especies bacterianas por la morfología colonial. Los medios de cultivo selectivos (Agar MacConkey, Agar manitol sal y agar Chapman Stone) inhiben el desarrollo de mecanismos no deseados, para lograr el crecimiento de una bacteria en un medio mixto o una muestra ambiental para describir el tipo de microorganismo, al igual que el medio de enriquecimiento (caldo selenita y el caldo tetrationato), donde se utilizan medios líquidos para inhibir ciertos géneros bacterianos para favorecer el tiempo de desarrollo de los que se encuentran en menor cantidad en una muestra. A comparación con estos anteriores, los medios de cultivo “de transporte” (medio de Stuart y medio de Carry-Blair) se utilizan para llevar la muestra de el lugar de recolección hasta el laboratorio en cuestión, para conservar la integridad del microorganismo que se requiere aislar. 2. Mencione un mínimo de 5 substancias inhibitorias utilizadas en los medios de cultivo y explique su acción. El cristal violeta se usa como inhibidor por su capacidad de inhibir el crecimiento de bacterias gram positivas. Al igual que lo hacen las sales biliares. El Acido benzoico es utilizado para inhibir el crecimiento fúngico y puede actuar en menor grado inhibiendo el crecimiento de bacterias. Se suele combinar con NaCl, acetatos y sulfitos. Y algunos otros antibióticos, como la ampicilina o tetraciclina, detergentes, colorantes, conservadores, etc., que ayudan al crecimiento de ciertas bacterias en especifico mientras afectan el crecimiento de otras.

3. Explique por qué no todas sus cepas crecieron en los medios inoculados. ¿Existen inhibidores? ¿Cuáles son? ¿Cómo actúan? La concentración alta de sales en agar manitol sal actúa como inhibidor de bacterias halointolerantes. En los agares MacConkey y XLD los inhibidores son las sales biliares, que, como se comento anteriormente, logran inhibir el crecimiento de bacterias gram positivas El agar Cetrimida es un detergente que libera N y P de las células inhibiendo su crecimiento. En el agar Verde brillante se encuentran inhibidores para gram positivos por su gran selectividad a gram negativos.

Bibliografía x 1. Garza velazco R, Zuñiga Rangel O, Perea Mejía LM. La importancia clínica actual de Staphylococcus aureus en el ambiente intrahospitalario. SciELO. 2012. 2. MONDRAGÓN JAIME DVA, VELAZQUEZ FERNANDEZ DJB, BUENO DURÁN DAY, ARVIZU GÓMEZ DJL, VENTURA RAMÓN MeCGH. MANUAL DE LABORATORIO DE FISIOLOGÍA BACTERIANA. 2017 Enero.. 3. Valenzuela-Núñez LM, Armendáriz-Erives S. USO DE ANTIBIOTICOS EN MEDIOS DE CULTIVO PARA REDUCIR LA PRESENCIA DE AGENTES CONTAMINANTES EN LA PROPAGACION in vitro DE PALMA DATILERA [https://chapingo.mx/revistas/revistas/articulos/doc/rchszaI867.pdf]. México. 4. Casado González MC, Torrico Cabezas G, Medina Anguita M. MEDIOS DE CULTIVO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA [https://libroslaboratorio.files.wordpress.com/2012/09/medios-de-cultivo-en-unlaboratorio-de-microbiologc3ada.pdf].; 2012. 5. Pedrique de Aulacio M, Gutiérrez de Gamboa S. Trabajo Práctico Nº 4: OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS [http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Obtenci %C3%B3n_de_cultivos_puros.pdf].; 2008. 6. DISTANCIA UNAYA. PRACTICA II DE MICROBIOLOGIA: medios de cultivo [https://labmicrobiologiayamileunad.files.wordpress.com/2011/09/guia-de-lab-ii-de-microb-yami-2011ii.pdf]. x

7. Massey, R. C., Horsburgh, M. J., Lina, G., Hõõk, M. and Recker, M., The evolution and maintenance of virulence in Staphylococcus aureus: a role for host–to–host transmission? Nature Reviews Microbiology, 4, 953–958, 2006...