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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIAFACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTALESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTALPREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.CLASIFICACIÓN DE MEDIOSSEGUNDO LABORATORIO DEL CURSO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL-BO-HUAMAN QUISPE, Angel Luciano ROJAS BORJA, Gabriel Eduardo ...

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERIA FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO. CLASIFICACIÓN DE MEDIOS SEGUNDO LABORATORIO DEL CURSO DE MICROBIOLOGÍA AMBIENTALBO-122

HUAMAN QUISPE, Angel Luciano ROJAS BORJA, Gabriel Eduardo DECENA SALINAS, Willy Jasiel DOCENTE: MSc. Blgo. Álvaro Martin Martínez Vila Lima, Perú 20 de noviembre del 2020

INDICE I.

RESUMEN

II.

INTRODUCCIÓN

III.

OBJETIVOS

IV.

MARCO TEÓRICO

V.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

VI.

RESULTADOS

VII.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

VIII.

FUENTES DE INFORMACIÓN

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I. RESUMEN En este laboratorio lo que se hará es la clasificación, preparación y distribución de los medios de cultivo. El procedimiento para ello es la realización de cálculos para el agar y el caldo. Se utilizarán materiales como los siguientes: placas preti, Erlenmeyer, probetas, tubos de ensayo, pipetas y demás. En cuanto a los medios de cultivo los más importantes se mencionarán a continuación: Agar plate count, peptona, caldo nutritivo y caldo BHI. También se tendrá en cuenta la relación de polvo de agar que se mezclará con agua. La esterilización en la autoclave será un punto fundamental en el proceso del cultivo. Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

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II. INTRODUCCIÓN Cuando a uno se le pregunta sobre medio de cultivo, uno pensaría en un lugar donde se cultiva una cosa en específico. En realidad, un medio de cultivo es un sustrato o una solución de nutrientes en los que crecen y se multiplican los microrganismos en el laboratorio con el objetivo de aislar diferentes especies bacterianas, con el fin de identificarlos y realizar estudios complementarios. En cuanto a su consistencia, tenemos los líquidos, sólidos y semisólidos, en donde la diferencia radica en que los medios líquidos se presentan como caldo nutritivo y caldo peptona, mientras que los sólidos se tienen al agar (un medio polisacárido obtenido de algas marinas) En cuanto a su composición y utilización tenemos como clasificación o siguiente: simples, enriquecidos, selectivos, diferenciales y enriquecimiento. En cuanto a su preparación, los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente. Generalmente se prefiere el uso de medios deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. Por mencionar algunas condiciones generales para su cultivo, tenemos: disponibilidad de nutrientes adecuados, consistencia adecuada del medio, presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases, condiciones adecuadas de humedad, luz ambiental, ph, temperatura y esterilidad del medio.

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III. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL -

Conocer la clasificación, preparación, esterilización y distribución de los medios de cultivo

OBJETIVOS ESPECÍFICOS -

Identificar los diferentes pasos a seguir en la elaboración de un medio de cultivo

-

Conocer los diferentes tipos de medio de cultivo existentes para el crecimiento de microorganismos en el laboratorio

IV. MARCO TEÓRICO 1. Medio de cultivo Son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones física óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Son esenciales en el laboratorio de microbiología por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura la exactitud y confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.

2. Clasificación 2.1. De acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes:

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- Medios naturales o complejos: constituidas por sustancias complejas de origen animal o vegetal, que son usualmente complementadas por la adición de minerales y otras sustancias. No se conocen los componentes ni las cantidades exactas - Medios sintéticos o definidos: Son los medios que tienen una composición química definida. Cualitativa y cuantitativamente. 2.2. De acuerdo al medio de cultivo: - Medios de enriquecimiento: Medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permite aumentar el número de microorganismos de ese tipo. Usualmente tiene una o más sustancias inhibidoras. - Medios selectivos: Se diferencian de los de enriquecimiento por ser sólidos y estar diseñados para el aislamiento de microorganismo específicos. - Medios diferenciales: Son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana, y no contiene alguna clase de inhibidor. Permiten revelar las características fisiológicas de los microorganismos. 2.3. Por su estado físico: - Líquidos: Contienen nutrientes a las cuales se les adiciona sustancias con la capacidad de mantener estables ph. Caldo nutritivo y peptona. - Semisólidos: Similares a los medios sólidos, con la diferencia de que estas presentan menos agar, lo que permite conservar cepas bacterianas. - Sólidos: Se obtiene agregando agar (una especie de polisacárido obtenido de algas marinas). Facilita obtener colonias bacterianas aisladas.

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3. Condiciones generales para el cultivo - Disponibilidad de nutrientes adecuados: Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. - Consistencia adecuada del medio: Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. - Presencia de oxígeno y otros gases: Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno

muy

reducida),

mientras

los

anaerobios

facultativos

tienen

un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

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- Condiciones adecuadas de humedad: Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio. - Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos. - Ph: La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales. - Temperatura: Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43 oC. Otros como los psicrófilos crecen a 0 oC y los temófilos a 80 oC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37 oC, y los saprofítos tienen rangos más amplios. - Esterilidad del medio: Los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo: autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).

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V. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 1. Materiales y equipos: 1) Agua destilada: 1000 ml. en un depósito, o Beaker. Agregar 6 gotas de NaOH 0,1 N a 1000 ml de agua destilada. Verificar pH = 7 aprox. (si pH es mayor, agregar HCl 0,1 N). 2) Agar Plate Count 3) Peptona (Bacto-Peptona) 4) Caldo Nutritivo 5) Caldo BHI 6) Erlenmeyer (250 ml): 8 7) Erlenmeyer (500): 4 8) Probeta (100): 4 9) Probetas (500) :4 10)Tubos de ensayo (16x 150 mm)= 42

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11)Papel Kraft/Mechero Alcohol/ Tripode/ Rejilla Asbesto/Guantes de asbestos (4 pares)/ Bombillas( 6), Encendedor 12)Alcohol, Algodón 13)Espátulas: 6 14)NaOH: 0.1 N; HCl : 0,1 N 15) Hornilla eléctrica (2) 16)Gradillas (6) 17)Balanza Analitica 18)Picetas con agua destilada 19)Pabilo, Tijeras, Pinzas, Cuchillo. 20)Pipeta 1 y de 10 ml sin esterilizar: 6 de cada una 21)Cinta pH 22)Verificar agua destilada en Autoclave 23)Adaptador (triple) para enchufes. 24)Mecheros Bunsen 2. Procedimiento: 1. Realizar los cálculos respectivos para agar y caldo teniendo en cuenta las especificaciones del fabricante. Para cada placa petri deben dispensar 15 mL de agar y para cada tubo 10 ml de caldo. Observación: Para caldos diluyentes se deberá dispensar en tubo 9mL. Ejemplo: Para preparar 6 placas petri con agar nutritivo, multiplique 6 por 15 ml = 90 ml 2. Mida el volumen de agua destilada según sus cálculos. 3. Teniendo en cuenta el volumen de agua a utilizar, haga la relación de polvo de agar que debe pesar de acuerdo a lo especificado en la etiqueta del medio. 4. Pese la cantidad del medio necesario de acuerdo a los cálculos. 5. Mezcle el polvo con la mitad del volumen de agua medida anteriormente, agite y adicione el restante de agua. 6. Lleve a hervir si es necesario (en caso de los Agares) 7. Esterilizar en la autoclave a 15 lb de presión a 121oC por 15 minutos.

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8. Sirva 15 mL aproximadamente de agar en cada placa petri cuando la temperatura este a 44-46oC, tápelas y deje solidificar. Lo mismo con los caldos sirva 10 ml en cada tubo y tápelos. 9. Déjelos enfriar y guárdelos en la nevera hasta su utilización.

VI. RESULTADOS

VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 1. Cuestionario 1. ¿Por qué se deben esterilizar los medios de cultivo? 2. Si no se realizan los cálculos adecuadamente para la preparación de los medios, ¿qué puede ocurrir en el momento de sembrar? 3. ¿Por qué se necesita ajustar el valor del pH en los medios de cultivo? 4. ¿Cuál es el papel de las sales biliares en algunos medios de cultivo? 5. Buscar la formulación del medio SIM y clasificar según los criterios establecidos e indicar la función de cada uno de los ingredientes.

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