Lezione 20 - appunti PDF

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STRATEGIA GENE TARGETING Nel costrutto del transgene sono presente due bracci di omologia nel locus genico che si vuole modificare - interrotti dalla mutazione introdotta che solitamente include l’inserzione di una cassetta di espressione per un MARCATORE DI SELEZIONE POSITIVO che interrompe o sostituisce una sequenza esogena. -

Il marcatore più usato è il gene che codifica la resistenza all’antibiotico G418 (NEOMICINA).

L’integrazione tramite RICOMBINAZIONE OMOLOGA genererà un allele difettivo in cui le SEQUENZE GENOMICHE comprese tra i due bracci di omologia sono sostituite dalle stesse sequenze contenute nel vettore. -

Più frequentemente tuttavia l’integrazione avviene in una regione casuale del genoma

Per ridurre il numero degli eventi di integrazione casuale si può usare contemporaneamente due tipi di selezione: positiva e negativa. Trasfezione del DNA clonato in cellule embrionali, iniezione delle cellule staminali nella blastocisti, generazione del topo chimerico che viene incrociato nel topo normale e selezione della progenie. Utilizziamo cellule staminali embrionali (pluripotenti) che danno origine a cellule di tutti i tessuti dell’organismo e l’unica differenza rispetto alle totipotenti è che non sono n grado a dare origine a cellula della placenta. Dalla blastocisti si prelevano cellule embrionali che sono pluripotenti in grado di dare origine ai tessuti tranne agli annessi embrionali. Le cellule vengono prelevate e bisogna inserire il transgene quindi identificare ed impiantare le cellule staminali ed embrionali nel topo dove è avvenuta la ricombinazione omologa in modo che viene tolto il gene di interesse. Operiamo un’AZIONE NEGATIVA e POSITIVA.

GENE che vogliamo eliminare, quindi facciamo KNOCKOUT che non abbiamo il SEGMENTO VERDE. Come lo eliminiamo? Le cellule del topo hanno il gene verde, noi vogliamo fare in modo che il segmento VERDE venga eliminato in modo da produrre un KNOCKOUT che avviene per RICOMBINAZIONE OMOLOGA, quindi abbiamo un scambio specifico. Se avviene la ricombinazione omologa, il verde che contiene la parte arancione (NEO) si mette al posto del verde integro, in questa maniera abbiamo generato KO. Perché il gene verde che deve ricombinare e che deve essere eliminato è interrotto da una CASSETTA del gene della NEOMICINA. Se io faccio crescere le cellule in presenza di neomicina resisteranno le cellule in cui è avvenuta la ricombinazione omologa (gene verde + arancione). Nel momento in cui abbiamo il gene arancio in mezzo al gene verde non ricombina più. Esiste il gene della TIMIDINA CHINASI, se avviene la ricombinazione omologa si scambia solo quello che rimane uguale (il TIMIDINA CHINASI NO). Se la ricombinazione non è omologa noi avremo che quando aggiungiamo il DNA clonato, se noi osserviamo le colonie di cellule con la neomicina sia dove è avvenuta la ricombinazione, sia dove (...) crescono solo con la resistenza alla neomicina (cellule che hanno avuto ricombinazione omologa).

Si aggiunge il GANCICLOVIR E funziona soltanto per le cellule con TIMIDINA CHINASI e uccide tutte le cellule che non hanno ricombinato in maniera autonoma. Quindi in questo modo seleziono le cellule in cui è avvenuta ricombinazione omologa. Il gene della TIMIDINA KINASI del virus dell’herpes viene perso solo nel corso dell’integrazione per RICOMBINAZIONE OMOLOGA. La selezione contro questa cassetta ucciderà la maggior parte delle cellule che avranno integrato il vettore casualmente mentre quelle andate incontro a ricombinazione omologa saranno in grado di crescere. GENE TARGETING -

GENERAZIONE di cellule staminali (prelevate dalla BLASTOCISTI)

Preparazione del vettore (il gene deve essere interrotta nella parte centrale dal gene della neomicina altrimenti quando si scambia non sarebbe più KNOCKOUT) -

Trasfezione delle cellule embrionali con il vettore

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Iniezione delle cellule trasfettate blastocisti

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Generazione dei topi mosaico

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Incroci successivi per ottenere l’animale con il transgene nella linea germinale

Il metodo della SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA non è infallibile, ma arricchisce la popolazione delle ES CELLS in elementi con TRANSGENE integrato nel sito CORRETTO. KNOCKOUT largamente studiato è un topo che ha P53 in tutte le cellule KO è una possibile mortalità degli omozigoti durante lo sviluppo, alcuni geni sono fondamentali e la loro assenza è incompatibile con la vita. Noi abbiamo dei KNOCKOUT COSTITUTIVI quindi un topo che ha P53 – DELETO in tutto le cellule. Il LIMITE principale è la MORTALITA’ degli omozigoti durante lo sviluppo. Alcuni geni sono fondamentali e la loro assenza è incompatibile con la VITA. La soluzione qual è? Indurre la mutazione (modifica genetica) o TEMPO/ TESSUTO E/O SPECIFICA. TEMPO Dopo la nascita so che ha una letalità embrionale (per il KO COSTITUTIVO) ed induco la mutazione genetica dopo la nascita oppure la induco perché so che nel cervello è possibile fare l’ablazione che si deve verificare in un determinato tessuto. Esistono dei topi KO in cui faccio un knockout condizionale. Questo KNOCKOUT usa un sistema che si chiama CRE-LOX, pubblicato su science da uno studioso che ha pubblicato questo targeting del gene inducibile utilizzando questo sistema. Sistema alla basa del KO CONDIZIONALE? Meccanismo di RICOMBINAZIONE del fago P1 con i siti LOX e la RICOMBINASI 3. CRE è una RICOMBINASI SPECIFICA che riesce a tagliare sequenze di DNA fiancheggiate da SITI DI RICOMBINAMENTO che vengono chiamati LOX P. L’escissione avviene grazie alla ricombinazione tra questi due siti. La CRE taglia perché riconosce i siti TRI LOX, i LOX P attirano la LOX 3 la quale ricombina le sequenze di DNA ADIACENTI. Queste sequenze sono SEQUENZE PALONDROME di 13 BASI.

La CRE riconosce le sequenze palindrome e taglia. È un meccanismo di ricombinazione del fago P1, con i siti LOX, si perdono le regioni mutanti con la regione voluta attivando la RICOMBINASI. Io voglio eliminare quel gene, clono quel gene (tra i GENI LOX P) e poi incrocio con un topo che produce RICOMBINASI 3 perché non viene prodotta dalle cellule di mammiferi e quindi ricombineranno soltanto quelle cellule che esprimono ricombinasi. Non esiste la ricombinasi che taglia il gene. si devono costruire del vettori con la regione genetica da eliminare con i siti LOX all’esterno. L’aggiunta della a ricombinasi taglia ed elimina il gene. La ricombinasi non è prodotta dalle cellule del topo, quindi la inserisco con un COSTRUTTO dove voglio eliminare il gene. Con questa strategia ottengo TOPI TRANSGENICI che sono fondamentali in fasi diverse e l’espressione della ricombinasi è TESSUTO SPECIFICA. Il KNOCKOUT avviene solo in particolari tessuti dove si esprime o induce la ricombinasi. Il sistema delle NOX viene utilizzato per produrre un KO CONDIZIONALE solo in alcuni tessuti? Clono il gene che voglio eliminare in un costrutto interno dei LOX P e poi introduco, per esempio se voglio fare un KO CONDIZIONALE NEL CERVELLO, faccio in modo di far esprimere ricombinasi in modo tale che la ricombinasi possa prendere il gene solo nelle cellule del cervello. Si possono comprare dei topi transgenici per RICOMBINASI, quindi esprimono ricombinasi con il metodo di TRANSGENESI STANDARD e possono essere COSTITUTIVI e quindi avere la ricombinasi in tutte le cellule, oppure che esprimono RICOMBINASI SOLO NEL CERVELLO. Incrocio un topo che ESPRIME RICOMBINASI con un topo in cui io ho inserito il COSTRUTTO CHE VOGLIO ELIMINARE all’interno dei SITI LOX P, ottengo un topo P53 LOX P RICOMBINASI POSITIVA. La RICOMBINASI va a tagliare le cellule con P53 fiancheggiate da LOX P. SISTEMA CRE LOX è molto utilizzato....