Mitschrift VO11 - Vorlesungsnotizen 11 PDF

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Vorlesungsnotizen 11...

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VORLESUNG TEIL 11 Der Initiationszyklus (E.coli) Die DnaA bindet an eine Reihe von 9 Basenpaare lange DnaA Boxen im oriC. Die Anwesenheit von DNA biegender Faktoren, wie HU und IHF. DNA, die durch negative Superspiralisierung von DnaA Nukleotidprotein destabilisiert ist, lösen das Aufschmelzen eines AT reichen DNA unwinding element (DUE) aus. --------------------------------------Sobald die DNA aufgeschmolzen ist, rekrutiert die DnaA die DnaB replikative Helikase an den Origin. DnaC Protein wird benötigt. Es lädt das DnaB Protein an die DNA. Dies wird unterstützt durch das DnaA Protein (DnaA muss geladen sein). Die DnaB lädt weitere Proteine für den Zusammenbau, beginnend mit der DnaG Primase. Der Ladefaktor DnaC geht wieder weg. Dies wird durch die Primase getriggert. Die Helikase liegt am geöffneten Origin vor und weitet den Bereich aus. Die Primase wird aktiviert und synthetisiert ein kurzes Oligonucleotid, den RNA-Primer. An Primer wird Sliding clamp geladen, dann bindet die Pol III und die Replikation beginnt.

Regulation der Initiation der DNA Replikation am oriC Wichtig um vorzeitige Re-Initiation zu verhindern. Initiation erfolgt nur, wenn sie erfolgen soll. Es kommt nur zur Replikation, wenn sie auch vollständig durchgeführt werden kann. Zelle muss genug Nährstoffe vorhanden haben. Replikation darf nicht zu oft erfolgen, denn die Replikationsgabeln bewegen sich auseinander. Teile der DNA würden mehrfach repliziert vorliegen, während andere noch nicht repliziert sind. Deshalb ist die Reinitiation strikt geregelt. Es gibt 4 Mechanismen, die eine zu schnelle Reinitiation verhindern:

1: Hemimethylierung der DNA am oriC Replikation von methylierter DNA ergibt hemimethylierte DNA, welche diesen eindeutigen Status an der GATC Stelle bebehält bis die DAM (Deoxy-AdenosinMethylase (N6)) den voll methylierten Zustand wieder herstellt. Hemimethylierte DNA wird von SeqA gebunden an GATC sites und kann von DnaA nicht erkannt werden (betrifft insbesondere low affinity DnaA Bindestellen). DAM: Deoxy- Adenosin- Methylase (N6) erkennt GATC

Im GATC motif wird A an beiden Strängen methyliert, weil DAM funktionsfähig ist. Normalerweise müsste 4er Nukleotid alle 250 Nukleotide auftreten, auf 250 Nukleotiden sind jedoch 11,10-mal so viele GATC Stellen vorhanden. Das ist ein Hinweis auf eine regulatorische Funktion. DNA muss an beiden As von GATC (in beiden Strängen) Methylgruppe tragen, damit sie DNAa erkennen kann. Nach der Replikation wird nur der Elternstrang methyliert, somit liegt hemi-methylierte DNA vor. Diese wird von DAM erkannt und in vollständig methylierte Form überführt.

2: Titration von DnaA an datA locus 84 min (in Nähe von oriC) Im Bereich von datA gibt es eine Vielzahl von DnaA Bindestellen (8-mal so viel wie am OriC), die durch die Replikation noch mehr werden. Es kommt zu einer Verteilung der zahlenmäßig begrenzten DnaA Moleküle und somit zu einer zu geringen Aufschmelzung der DNA. 2 Replikationsgabel gehen in 2 Richtungen. Die Replikationsgabel geht über datA locus: Dann hat man nicht mehr 8-mal so viele Bindestellen sondern 16. Dh DnaA bindet bevorzugt an datA und nicht an OriC. (WH) Es wird etwas im Überschuss angeboten. Dort wo Bindestellen vorhanden, wird bevorzugt gebunden. Wenn für ursprüngliche Bindestelle zu wenig von Protein zur Verfügung ist. Replikationsgabel 2 DatA Locus. Bindestellen für 2x8, 16mal so viel DnaA , DnaA steht nicht mehr für Reinitiation zur Verfügung.

3: ATP Hydrolyse von ATP-DnaA zu ADP-DnaA (durch Hda und ß-Untereinheit von Pol III) Hda wird durch β-Untereinheit der DNA Polymerase rekrutiert und triggert ATP Hydrolyse von ATP-DnaA (RIDA: regulatory inactivation of DnaA) ATP-DnaA > ADP-DnaA Kein geschlossener Ring, keine Untereinheit die ATP - Hydrolyse an nächster Untereinheit initiiert. Hda Protein bindet an dieser Stelle. Beta clamp wird geladen, Hda Protein kommt dorthin und führt dazu dass ATP hydrolysiert, abfällt und nicht mehr neu initiiert werden kann. (WH) Es geht nicht ohne ATP Bindung, kann Initiation nicht einleiten. DnaA ist an Origin gebunden - durch beta clamp wird Hda rekrutiert, triggert ATP - Hydrolyse in erster DNA UE, wird weitergegeben auf 2.3... UE. DnaA hat dann ADP gebunden und die Affinität zur DNA geht verloren. Sie fällt ab und kann nicht neu initiiert werden. ADP muss regeneriert werden.

4: DARS1 und DARS2: Austausch von ADP-DnaA zu ATP-DnaA. Kurz vor Initiation ca. 70% ATP-DnaA, in DARS1/2 Mutanten nur 30% ATP-DnaA. Folge: Stämme teilen sich langsamer. Bild: Region die drei DNA Bindestellen aufweist. Es gibt Sequenzen die fördern den Austausch von ADP-DnaA zu ATP-DnaA. Der Austausch ist notwendig, sonst gibt es keine Initiation der Replikation. DARS: „DnaA Reactivating Sequence“ (WH) DARS, DnaA bindet an diese Dna Bindestellen, helfen DnaA dass es ADP gegen ATP austauscht.

Replikations- Termination in E. coli Sequenzen, die die Replikation stoppen sind in der Form der ter Elemente auf E. Coli Chromosomen entdeckt worden. Sie haben jeweils eine 23 Basenpaare lange Consensus Sequenz. Von den 23 bp sind 13 hoch konserviert. Diese Consensus Sequenz stellt eine Bindestelle für das Produkt der tus Gene dar, ein 36kDa schweres Protein, das notwendig ist für die Termination. Tus bindet an die Consensus Sequenz, wo es eine kontra-Helikaseaktivität bereitstellt und die DnaB stoppt. Der leading Strang wird weiter synthetisiert bis zu dem ter element, während der nächste lagging Strang ca. 50-100 Basenpaare vor dem Erreichen von ter initiiert ist. Durch diese Hemmung, wird die Replikationsgabel aufgehalten und der Abbau des Replikationsapparattes verursacht. Die Struktur von Tus ist so, dass sich tus asymmetrisch an die DNA bindet, so dass Tus in die eine Replikationsrichtung zwar funktioniert, in der anderen Replikationsrichtung von dem Replikationsapparatt einfach weggeschoben wird. Tus-Protein bindet um Faktor 10.000 stärker als das DnaA Protein. Die DNA Helicase von "oben" kann tus Protein nicht verdrängen. Auf anderer Seite kann sie es verdrängen. Tus wirkt als Helicase Blocker. (WH) Ter Bindestellen für tus Protein - hat hohe Affinität zur Dna, bindet an ter Sequenzen, wirkt als Helicase Blocker.

Replikation in Eukaryonten Eukaryontische Replikons: Origin ist der Bereich, wo die Replikation beginnt. Replikon ist der Bereich, der von einem Origin aus repliziert wird. Die chromosomale bakterien DNA hat einen Origin und einen Replikon, das heißt es wird alles auf einem repliziert. Bäckerhefe hat 500 verschiedene Replikons. Auf jedem Chromosom liegen einige Replikationsursprünge. Ein durchschnittliches Replikon hat 40kb. Eukaryontische Replikons sind klein und replizieren deutlich langsamer als bakterielle DNA. (WH) Eukaryonten: haben mehr Replikons, dafür wesentlich kürzer, und Replikationsgeschwindigkeit ist geringer - weil DNA komplexiert.

Säuger DNA-Polymerasen Es gibt 5 Säuger DNA Polymerasen: DNA Pol alpha (I): hat Priming Funktion. Sie besteht aus 4 Untereinheiten. Die größte UE hat ungefähr 100 Kilodalton (Polymeraseaktivität). Die 2 kleinsten UE haben Primaseaktivität. Sie ist ein multifunktionelles Enzym. Sie macht bei Säugern was in Prokaryonten das DnaG Protein macht. Es wird ein kurzes RNA-Fragment gebildet - IRna. Es werden gleich 60 Desoxyribonucleotide angehängt. Sie hat keine proof reading Aktiviät und wird durch Pol delta oder Pol epsilon verlängert (delta und epsilon haben proof reading Aktivität). Sie teilen sich vermutlich die Stränge. Ähnlich wie Bakterien gibt es Dimere bei der Pol. Bei den Eukaryonten synthetisiert Pol epsilon den Leitstrang und Pol delta den Folgestrang. Für die eukaryontische Replikation sind 2 DNA Polymerasen und einige andere Replikationsfaktoren nötig: PCNA: Die Sliding clamp besteht aus PCNA. Sie ist strukturell verwandt zur beta Untereinheit von Pol III. In Eukaryonten ist sie ein Trimer, in Bakterien ein Dimer (2 UE). Sie ist ein Prozessivitätsfaktor und assembliert die delta Polymerase. Man weiß nicht ob es auch an epsilon Pol assembliert. Die Prozessivität von delta Pol ist somit stark erhöht. Replikationsfaktor ladet PCNA an die DNA. Replikationsfaktor A ist ein Singlestrand binding protein.

(WH) alpha Pol: macht Primer, wenig prozessiv, besteht aus 4 Untereinheiten, größte UE ist DNA Polymerase, zwei kleinere wichtig für RNA - Polymerase Aktiviät; Pol delta und Pol epsilon haben höhere Prozessivität. Bei Eukaryonten gibt es noch zusätzliche DNA-Pols, z.B. eine in Mitochondrien, Reparatur Pols, in Chloroplasten, Error prone DNA Pol (ca 10 Stück). Replikationsfaktor a, PCNA - Sliding clamp - in Eukaryonten Trimer, Öffnung in der Mitte, ausgekleidet mit alpha-helicalen Elementen, dafür verantwortlich dass DNA Pol nicht hinunterfallen kann, spielt Rolle für Pol delta, bei epsilon weiß man nicht. Exonukleasen, 3'5' Ex. delta-epsilon; 5'3' Exonukleaseaktivität haben Eukaryonten nicht, brauchen z.B. MF1, FAN1

Replikations-Ursprung in Hefe: ARS (Autonomously Replicating Sequences) Hefe Origin of replication Motive werden ARS genannt, autonomously replicating sequences (selbstständig replizierende Sequenzen). Sie haben AT-reiche Consensussequenzen. Es gibt ca 500 ARS Elemente in der Bäckerhefe, also 500 Origins. Bild - schwarze Striche sind Replikons.

Origins in Eukaryonten Die Origins sind unterschiedlich: –Knospende Hefe (S. cerevisiae): ARS = 130 bp – sich teilenden Hefe (S. Pombe): ARS = 450 Bp – Säugertiere: B2 origin, ORC binding site = 78 Bp zusätzlich gibt es B1, B2 und B3. Jeder Origin hat eine B1 Region, vielen fehlt jedoch die B3 Region. An B3 bindet Transkriptionsfaktor. B2 - Aufschmelzen. ORC Komplex bindet an ARS Elemente; ORC - aus 6 ORC Proteinen - konserviert. DUE (DNA unwinding element) ORC (Origin recognition complex) AT - hook ausgebildet;

Origins in Säugern AP1 besteht aus einem Dimer. Es hat lange alpha helicale Elemente. Die Position von ORC korreliert mit den Bindestellen für AP1. In 20% von ORC in Nachbarschaft AP1 vorhanden. AP1 interagiert mit HBO1. Die meisten Origins überlappen mit transkriptionell regulierten Elementen, was eine Rolle für Transkriptionsfaktoren bei der regulierten Origin Auswahl spielt. Das könnte entweder durch direkte oder indirekte Rekrutierung von Untereinheiten des pre-replicative complex oder durch Trankskriptionsfaktoren erreicht werden . Der AP-1 Komplex ist mit 20% der bekannten Origins in der Humanzellen assoziert. Es wird vermutet dass er in die Origin Auswahl involviert ist. AP-1 rekrutiert spezielle die Histone acetyltransferase HBO1. Dieser Faktor ist zuständig, für die Kontolle der Origingenehmigung in Absprache mit AP-1 in der Rolle des Origin Auswählenden. (WH) Replikation kann in größerem Bereich starten, je höher roter Strich desto höher w'keit dass es initiiert, AT-reiche Regionen, Korrelation zw. Initiationsstellen und Transkriptionsfaktoren wie z.B. AP1, bilden Dimer aus; AP1 in 20% in der Nachbarschaft der Origins, eukaryontische Orgins mit Transkriptionsfaktoren, HPO1, ermöglicht Bildung von ORC Komplex - aus 6 Proteine, essentiell für DNA Replikation....