Obtencion DNA de espinaca o guayaba PDF

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Practica 13 y 14 Obtencion DNA...

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BIOQUÍMICA Práctica No.12 y 13:”Aislamiento de DNA de espinaca o guayaba/ Hidrólisis del RNA y DNA de bases púricas y pirimídicas por cromatografía fina ”

Integrantes ● Bastida Almaraz Maria Fernanda ● Lopez Pedraza Carlos Fernando Equipo: 4.3

estructurales o monómeros, denominados Nucleótidos. De acuerdo con la composición química, los ácidos nucleicos se clasifican en Ácidos Desoxirribonucleicos (ADN) que se encuentran residiendo en el núcleo celular y algunos organelos, y en Ácidos Ribonucleicos (ARN) que actúan en el citoplasma. El protocolo básico de extracción de DNA consiste en el tratamiento del homogeneizado con disolventes orgánicos (fenol, cloroformo o ambos). Para evidenciar la presencia de ácidos nucleicos en extractos celulares vegetales se requiere células en cantidad suficiente y en medio libre de interferencias que puedan causar lisis celular o hidrólisis de los ácidos nucleicos por nucleasas. Un método más adecuado para disociar al DNA de la proteína consiste en utilizar detergentes aunque, como método alternativo, también se emplea mucho el fenol.

Sección: 4 Fecha de entrega: 09/06 /2021 INTRODUCCIÓN las la

Las bases nitrogenadas tienen la propiedad de absorber la luz ultravioleta. Esta propiedad permite

Son biopolímeros, de elevado peso molecular, formados por otras subunidades

identificarlas y cuantificarlas, ya que cada base presenta un espectro de absorción característico con

Los Ácidos Nucleicos biomoléculas portadoras información genética.

son de

una longitud de onda máxima de aproximadamente 260 nm. OBJETIVOS ● Aprender caracteristicas generales sobre el DNA y RNA ● Aislar DNA a partir de espinaca o guayaba. (fresas o plátano) ● Realizar hidrólisis ácida de DNA y RNA. ● Realizar una cromatografía en capa fina para separar el DNA y RNA.

RESULTADOS

Imágenes 1 y 2 Obtención DNA de fresa

Imagen 3 Obtención DNA plátano

Aislamiento DNA espinaca o guayaba Pasos

¿para que se realizó?

Colocar 15 g de guayaba/espinaca

Es el vegetal de donde vamos aislar el DNA

Adicionar TRIS/EDTA/NaCl

TRIS: Mantener pH adecuado EDTA: Sustancia quelante que atrapa iones Mg y Ca NaCl: Tener una fuerza iónica adecuada

Triturar 3 a 5 min

Romper la pared y poder obtener más fácilmente el DNA

adicionar 0.3 mL de amilasa. Mezclar e incubar 10 min a temp ambiente. Agitar ocasionalmente Agregar solución saturada NaCl y SDS

Amilasa es para romper el almidón NaCl para separar las histonas por salting out Detergente: Lisis, va a romper la membrana fosfolipídica de la celula

Filtrar a traves de tela sintética

Obtener el DNA libre de sedimentos

Adicional 15 mL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) tapar tubo y agitar

Para separar las proteínas liberadas por salting out

Centrifuga 4000 rpm 10 min

separar las fases Acuosa: DNA y moléculas polares Orgánica: Lípidos

Recuperar sobrenadante

Contiene el DNA

Verter el sobrenadante con alcohol etílico 96° frio

Hacer que el DNA ascienda

recuperar DNA con varilla de vidrio

Obtener el DNA

dejar escurrir el alcohol y disolver el DNA con sol citrato salina diluida

Solubilizar el DNA con citrato

Hacer una dilución 1:10 con la solución de citrato diluida

Poder poner en el espectro y realizar su caracterizacion

Leer absorbancia en espectro

Determinar absorbancias

DISCUSIONES La obtención de DNA la realizamos a partir de plátano y/o fresa, tomamos una porción de ambas frutas para así romper las paredes celulares, despues de esto añadimos agua mineral en lugar del TRIS/EDTA/NaCl ya que con este sustituimos, por qué el agua mineral contiene el EDTA y sales, después filtramos nuestra mezcla , para que solo quede nuestro extracto de la fruta con el DNA, después le agregamos una solución que lleva detergente con la función de ocasionar la lisis romper la membrana fosfolipídica de las células vegetales, esta igual contiene sal y bicarbonato de sodio que son para que se separen las proteínas por “salting out”, en un vaso se agregó poco del extracto con esta solución con detergente y sales, para asi despues homogeneizar, posterior utilizamos alcohol etílico frío el cual nos sirvió para hacer ascender el DNA y así poder recuperarlo con un palillo y observar, como se ve en las imágenes 2 y 3. En el laboratorio se esperaría obtener la lectura de las absorbancias para asi hacer el espectro de absorción (que es una huella digital) en el eje de las ordenadas vamos a tener el valor de las absorbancias y en el eje de las abscisas tendremos los nanómetros, con la finalidad de realizar la caracterización del DNA, se esperaría tener un pico máximo de 260 nm en la longitud de onda, lo que indica que nuestra sustancia es DNA, si se observan varios picos podría ser debido a que no estaba completamente puro y había presencia de proteínas. como se observa en esta imagen:

El espectro tambien nos sirve para realizar técnicas cuantitativas como para calcular la concentración de DNA hay varios métodos entre estos se encuentra el nomograma, con el coeficiente de extinción molar asi como utilizando una solución conocida y realizando reglas de 3. Para la cromatografía se realiza una hidrólisis ácida, en la cual buscamos identificar las bases nitrogenadas que contiene el DNA y el RNA se va a revelar con la luz UV, en el cual esperamos observar diferencias en el DNA observaremos adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina, En el ARN, la base uracilo (U) ocupa el lugar de la timina. Conclusiones ● El DNA y RNA contiene la información genética. ● El DNA se puede aislar de las células vegetales siguiendo una metodología adecuada ● Las bases nitrogenadas absorbe la luz UV por esto es posible identificarlas en la cromatografía ● En el DNA y RNA se diferencian por las bases nitrogenadas.En el ARN, la base uracilo (U) ocupa el lugar de la timina

Referencias bibliográficas ● Mathews C., Van Holde & Ahern K. (2008). Bioquímica. 3a edición. Pearson Education. ● Voet D., Voet J.G., “Biochemestry” Editorial John Wiley & Sons, Inc., 3a Ed. (2004). ● Campbell M.K., Farrel S.O., “Bioquímica”, Thomson Editores, 4a. Edición,(2004). ● McKee T. y McKee J. R. “Bioquímica” La Base Molecular de la Vida. Ed.McGraw-HillInteramericana, (2003)...