OSNA - resumen de examen de laboratirio patologico sobre osna en ganglio centinela PDF

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resumen de examen de laboratirio patologico sobre osna en ganglio centinela...

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OSNA – La nueva generación de análisis de ganglios centinela en cáncer de mama La biopsia de ganglios centinela se ha establecido rápidamente como el procedimiento de referencia para el estudio de metástasis en pacientes con cáncer de mama

clínicamente

negativos. El análisis intraoperatorio convencional de ganglio centinela hasta ahora se realizaba mediante corte por congelación o impronta citológica con tinción rápida en hematoxilina y eosina (H&E). Estos métodos histopatológicos, debido a que de forma intraoperatoria únicamente permiten examinar una pequeña proporción del ganglio centinela, tienen una baja sensibilidad. A consecuencia de ello, existe un riesgo considerable de obtener falsos negativos, resultados negativos en el análisis intraoperatorio que son identificados como positivos en el estudio postoperatorio, haciendo que sea necesaria una segunda intervención quirúrgica para realizar el vaciamiento axilar. El análisis OSNA (One Step Nucleic Acid Amplification) constituye un nuevo enfoque diagnóstico que ya está ampliamente establecido y que, por primera vez, permite analizar la totalidad del ganglio linfático de manera intraoperatoria. De esta forma es posible tomar una decisión clínica definitiva sin necesidad de realizar un segundo procedimiento quirúrgico o un análisis histopatológico confirmatorio. Tecnología avanzada OSNA es un ensayo de diagnóstico molecular automatizado que utiliza la 44amplificación de ácidos nucleicos para detectar a nivel de ARNm el grado de expresión del gen que codifica para la citoqueratina 19 (CK19). La CK19 es un marcador de células epiteliales que en condiciones normales no se expresa en el tejido linfático. La presencia de ARNm de CK19 se corresponde con el tamaño de los focos metastásicos presentes en el ganglio centinela. La evaluación del resultado de la paciente se basa en una curva estándar realizada con anterioridad donde se utilizan tres calibradores con diferentes concentraciones conocidas de ARNm de CK19. Selección del marcador Durante el desarrollo del método OSNA, se seleccionó 45 marcadores de ARNm candidatos, a partir de una base de datos pública de expresión de genes humanos. Los criterios de selección fueron detectar una elevada expresión en tejidos de la glándula mamaria en combinación con una expresión mínima o ausente en tejido sano de los ganglios linfáticos. El índice de expresión de estos marcadores se

evaluó utilizando ganglios linfáticos positivos y negativos desde el punto de vista histopatológico (Figura 1a y 1b). En un segundo paso se llevó a cabo una evaluación adicional de los siete marcadores candidatos más prometedores, caracterizados por una expresión elevada del ARNm en ganglios linfáticos positivos para metástasis y por una expresión mínima en ganglios linfáticos negativos. Este análisis identificó el marcador CK19 como el más adecuado, al mostrar niveles altos de expresión en ganglios linfáticos metastásicos y niveles bajos de expresión en ganglios linfáticos no metastásicos, por lo que ofrece tanto el potencial de una elevada sensibilidad como la capacidad para discriminar entre ganglios linfáticos metastásicos y no metastásicos. Tecnología RT-LAMP La innovadora tecnología de amplificación RT-LAMP es un procedimiento isotérmico rápido que ofrece diversas ventajas respecto a los métodos de PCR convencionales. La reacción de amplificación tiene lugar en 16 minutos sin necesidad de purificar previamente el ARN La tecnología RT-LAMP utiliza seis primers distintos, específicamente diseñados para evitar la amplificación de pseudogenes de la CK19 o de sus productos de transcripción, así como para acelerar la reacción del ensayo. Primer LAMP La amplificación no deseada del ADN genómico se evita debido a la precipitación del ADN a pH bajo (3,5) durante la preparación de las muestras y a la temperatura de reacción isotérmica de 65°C. El proceso se monitoriza en tiempo real en el sistema automatizado de amplificación y detección RD-100i. Los resultados están disponibles en aproximadamente 30–45 minutos después de la llegada de la muestra, dependiendo del número de ganglios analizados. Estudios de validación clínica y resultados El método OSNA ha sido evaluado en diversos estudios multicéntricos en distintos países. En todos estos estudios OSNA se comparó con un examen histopatológico muy extenso. Los ganglios linfáticos se dividieron en 4 secciones de un grosor de 1 ó 2 mm. Se asignaron secciones alternas para el ensayo OSNA y para el análisis histológico de múltiples niveles en cortes permanentes. Los cortes se tomaron de 5 niveles con segmentos intermedios de 100, 200 ó 250 µm. En resumen, el análisis de 2.313 ganglios linfáticos generó los siguientes datos de rendimiento:

Como parte de un estudio multicéntrico japonés se pudo demostrar que la especificidad del método OSNA en pacientes pN0 (144 ganglios linfáticos analizados) era del 100% :

El número de copias de ARNm de CK19 en los ganglios linfáticos negativos, objeto de análisis en este estudio de especificidad, fue considerablemente menor que el valor de corte para el ensayo OSNA. Este hecho es una sólida indicación de que prácticamente puede excluirse el riesgo de obtener falsos positivos. Los resultados de todas las evaluaciones clínicas muestran que el ARNm de la CK19 es un marcador molecular excelente para la detección de las metástasis de ganglios linfáticos en el cáncer de mama. En conclusión, el ensayo OSNA puede aplicarse como herramienta diagnóstica para la detección rápida de metástasis en biopsias de ganglio centinela en pacientes con cáncer de mama....