Pflanzenbiotech Fragenkatalog mit Antworten Stoppo PDF

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Pflanzenbiotechnologie Fragenkatalog mit Antworten WS 12/13 (16/17 abgeglichen/ ergänzt) 1. Introduction 2. Establishing transgenic plants 3. Selection of transgenic plants and tissue culture 4. Input traits I: herbicide tolerance, insect and virus resistance 5. Transient transformation 6. Input traits II: stress tolerance 7. Output traits I: proteins, lipids, carbohydrates 8. Plant-made biopharmaceuticals 9. Output traits II: secondary metabolites (e. g. vitamins) 10. Commercial uses, field trials, safety issues 11. Non agricultural uses of GMO plants 12. Renewable resources (Nicht stattgefunden! ) 13. Plant phenotyping I 14. Plant phenotyping II (Vorlesung ausgefallen!) Klausur am 08.02.2013 Raum: N6/7 Zeit: 08:30

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05.10.2012 12.10.2012 19.10.2012 26.10.2012 02.11.2012 09.11.2012 16.11.2012 23.11.2012 30.11.2012 07.12.2012 14.12.2012 21.12.2012 11.01.2013 18.01.2013

Raven Raven Raven Schiermeyer Raven Schiermeyer Schiermeyer Schillberg Schillberg Schiermeyer Schillberg Schillberg Janzik Janzik

1. Introduction 1. Nennen Sie die fünf wichtigsten Kulturpflanzen. Von welchen dieser Pflanzen werden transgene Varianten in großem Maßstab kultiviert? Reis, Weizen, Soja, Mais, Kartoffeln 2. Beschreiben Sie klassische und moderne Züchtungsansätze. Worin liegen die Vor- und Nachteile der jeweiligen Methoden? • Klassische Ansätze: (Mischen von Genen) Auslesezüchtung: - Startpunkt sind Wildtyp-Pflanzen (Landsorten) - Pflanzen mit vorteilhaften Eigenschaften werden zur weiteren Züchtung ausgewählt - genet. Variation wird während dieses Auswahlprozesses eingeschränkt Kombinationszüchtung: - Kreuzung versch. Genotypen von einer Spezies ergeben einen neuen Genotyp in der F1- Generation - Entstandene Bastards zeigen neue Kombinationen von Eigenschaften und werden für verbesserte Leistung ausgewählt - Eigenschaften die, die Elterngeneration nicht besitzt können auftauchen Mutationszüchtung: - zufällige Mutationen des Saatgutes entstehen durch Strahlung, chem. Agenzien oder Hitzeschocks/ Kälteschocks - nur ein geringer Teil des mutierten Materials wird zur weiteren Züchtung durch Rückkreuzung mit eingesetzten Hersteller- Linien genutzt, um die neuen Eigenschaften einzuführen Hybridzüchtung: - aus heterozygoten gekreuzten Pflanzen werden homozygote Inzucht- Linien generiert (Pflanze bestäubt sich selber) - man kreuzt 2 Inzucht- Linien und man erhält eine F1- Generation mit den gewünschten Eigenschaften wie Robustheit und Produktivität (Heterosis- Effekt… nicht stabil, dieser Effekt geht in der nächsten Generation [F2- Generation] verloren! siehe: Mendelsches Gesetz) • Moderne Ansätze: (Gezieltes Einbringen der Gene) Genetische Moditokation: - Durch Pflanzenbiotechnologie kann man ein einzelnes Gen in ein Pflanzengenom hinzufügen. Dabei spielen Artgrenzen keine Rolle (z.B. Transfer eines Mikrobengen ins Pflanzengenom)  Vorteile / Nachteile: Klassisch: + es kann eine große genetische Vielfalt entstehen - Lange Dauer der Züchtung (10-15 Jahre) Modern: + schnelle Methode 3. Nennen Sie mindestens vier Ziele der Züchtung. - höhere Resistenz gegen Herbizide, gegen Insektizide - höhere Salztoleranz, höhere Hitzetoleranz - höhere Ausbeute (Quantität ) - größere Fruchtkörper - bessere Qualität (z.B. Haltbarkeit) 4. Wie heißt das chloroplastenreiche Gewebe der Blätter höherer Pflanzen?  Mesophyll

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5. Skizzieren Sie die Mesophyllzelle einer höheren Pflanze mit ihren subzellulären Kompartimenten. 

+Cytosol und +Chromatin im Kern

6. Wie heißen die drei Hauptbestandteile der pflanzlichen Zellwand? Beschreiben Sie deren Aufbau. - Cellulose (ca.90%): Langkettig (bis zu 25000 Einheiten) ß-(1-4)-glykosidisch verknüpfte Glycosemoleküle, 36 Ketten formen dabei eine Mikrofibrille, wasserabweisend, Wichtig zur Stabilität - Hemicellulose: Beinhaltet eine Vielzahl von verzweigten polysacchariden aus Pentosen und Hexosen. - Pektin: Mischung aus polymerisierten Zuckersäuren. Wichtigtes Monomer: D- Galaktuonsäure ( alpha-1,4glykosidische Bindung), Je 2-3 Carboxygruppen werden durch bivalente Ionen (Ca2+, Mg2+) zusammen gehalten. Ohne diese Ionen ist Pektin eine lösliche Verbindung, Gel. [Hemicellulose und Pektin sorgen zusammen für die Dehnbarkeit der Pflanzenzelle!] 7. Charakterisieren Sie kurz die Primär- und Sekundärzellwand der Pflanzen. Primar: - Hauptsächlich aus Pektin und Hemicellulose aufgebaut - Etwa 30% Cellulose - Streuungsstruktur - Wand ist noch dehnbar Sekundär: - Cellulose-Anteil größer als 60%; wenig Pektin, Rest hauptsächlich Hemicellulose - besteht aus lamellaren Schichten von Mikrofasern, die in einer Sperrholz-Struktur angeordnet sind - Einschluss von Lignin in sekundären Zellwänden führt zur Verholzung - Wand nicht mehr dehnbar

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8. Was versteht man unter Plasmodesmen? -Verbindungen zwischen Zellen (Durchgang durch die Zellwand einer Pflanzen-Zelle hindurch zur Nachbarzelle) - Ermöglicht Stoffaustausch mit benachbarten Zellen - ca. 1000-10.000 pro Zelle Symplast: Gesamtheit der Zelle, welche über Plasmodesmen verbunden sind. Apoplast: Zwischenraum zwischen den Zellen. 9. Welche 5 Plastidentypen bei höheren Pflanzen kennen Sie, was sind ihre jeweiligen Hauptmerkmale, wie heißt die gemeinsame Vorstufe der Plastiden?  gemeinsame Vorstufe: Proplastid Chloroplast: - enthält Chlorophyll und andere Pigmente - Ort der Fotosynthese Chromoplast: - kein Chlorophyll - enthält aber Carotinoide, Carotine und Xanthophylle (gelb, orange, rot) - häufig in Blüten - kann von Chloroplasten nach Verlust des Chlorophylls abgeleitet werden Amyloplast: - unpigmentiert - Depot für Stärke im Stroma - Treten gehäuft in Speicherorganen wie z.B. Wurzeln oder Samen auf Leukoplast: - farblos - Produktion von Monoterpenen (Lipide) - Wichtig für Aromen 10. Erläutern Sie anhand einer Skizze und einer stichpunktartigen Beschreibung das Zusammenspiel zwischen dem rauhen endoplasmatischen Reticulum und dem Golgiapparat in der Zelle einer höheren Pflanze. Der Golgiapparat empfängt Proteine und Lipide in Transportvisikeln vom ER. Diese Proteine und Lipide werden Zwischengespeichert bzw. in Sekretorische Visikel überführt, welche anschließend in Vakuole aufgenommen oder aber durch Exocytose aus der Zelle geschleust werden.

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11. Zeichen Sie einen Blattquerschnitt und beschriften Sie alle relevanten Strukturen.

2. Establishing transgenic plants 1. Nennen Sie kurz wesentliche Merkmale des Pflanzengenoms. -

trägt Infos für über 25.000 Gene  auf 5 Chromosomen lokalisiert Zusätzlich Gene für rRNA, tRNA und kleine RNA’s Durchschnittliche Größe der Gene ist 1,9–2,1 kbp (Kilo-Basenpaare=1000bp) Funktion für 30% der Gene ist unbekannt Gründe für die riesige Größe mancher Genome: Duplikation und Transposons

2. Nennen Sie die Ihnen bekannten Methoden zur Identifizierung von Zielgenen. Gensequenzen / Bioinformatische Methoden: - Ein Sequenzvergleich mit Homologen kann Aufschluss über die Gen-Funktion geben; aber nicht über die physiologischen Auswirkungen Forward Genetics: - Erst Phänotyp einer Mutante charakterisieren und darauf mutiertes Gene identifizieren Reverse Genetics: - Von den Genen zu den Funktionen ▪ Homologe Rekombination ▪ Gene-silencing ▪ Chemische Mutagenese ▪ Insertionsmutagenese Transcriptomics: - Regulation der Genexpression wird Mithilfe von DNA-Arrays analysiert

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3. Erläutern Sie das Prinzip der Transposonmutagenese. Prinzip: - Transposon springt in den ORF eines Gens (ORF= Open Reading Frame, DNA-Bereich von Start- bis Stopcodon)  ORF ist gestört und es findet keine Genexpression statt  neue Mutationen, es entsteht neuer Phänotyp Nutzung: Selektive Transposonmutagenese - Es wurden Vektoren konstruiert die eine Selektion auf erfolgreiche Transposition erlauben  Transposon liegt auf dem Plasmid in dem ORF eines Resistenzgens, sobald es aus dem ORF des Vektors in das Pflanzengenom „springt“ kann das Resistenzgen auf dem Vektor abgelesen werden und die Pflanze erhält die entsprechende Resistenz. 4. Durch welche beiden Mechanismen lässt sich die Genexpression in Pflanzen regulieren? Nennen Sie jeweils zwei Beispiele. Genetische Mechanismen: - abhängig von der Nukleotidsequenz - kann durch Anheftung von N- o. C-terminaler Sequenzen kontrolliert werden - Beispiele: Promotorsequenz, Spleißsignale Epigenetische Mechanismen: - unabhängig von der Nukleotidsequenz - Abhängig von der Integration des Transgens und der örtlichen Organisation (Positionseffekt) - Beispiele: Chromatinstruktur, DNA-Methylierung 5. Welche Gene enthalten die tumorinduzierenden Plasmide von Agrobacterium tumefaciens? -

T-DNA: LB: Ori: Noc: Nos: Tra: Vir: Tmr: Tms:

Transfer-DANN (beinhaltet Nos, Tmr, Tms) left border; RB: right border Startpunkt der Replikation Nopalin Katabolismus Nopalin Synthese Transfer durch Konjugation Virulenz-Region Cytokinin Synthese Auxin Synthese

6. Welche Typen von tumorinduzierenden Plasmiden kennen Sie und wie unterscheiden sich diese? - Octopin-Typ - Nopalin-Typ - Agropin-Typ - Opalin-Typ - Opine sind stickstoffreiche organische Verbindungen (Reich an C und N). Die Bakterien übertragen die Gene für die Opinsynthese in die Pflanzenzelle. Zu den Opinen zählen z.B. Octopin, Nopalin, Agropin, Opalin. Den Pflanzen ist es selbst nicht möglich, Opine zu verwerten  werden nur durch die Bakterien metabolisiert (=verstoffwechselt). - Die unterschiedlichen Ti-Plasmide unterscheiden sich also darin, dass sie die Synthese von verschiedenen Opinmolekülen bewirken. - Die verschiedenen Opine unterscheiden sich im molekularen Aufbau. 7. Was sind Opine? Wie werden Sie gebildet und welche Funktion haben sie? Siehe 6. Bakterien induzieren Pflanzen um die Komponenten für das bakterielle Wachstum zu produzieren!

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8. Skizzieren und beschreiben Sie in Stichworten die Infektion einer höheren Pflanze mit Agrobacterium tumefaciens. Was ist die Voraussetzung für eine Infektion? - Voraussetzung: Pflanze ist verletzt dadurch produziert sie phenolische Komponenten wie Acetosyringon - Bakterium detektiert die Verletzung durch einen Rezeptor (VirA), dieser induziert die Expression weiterer VirGene - Agrobacterium heftet sich an Zelle an und transferiert T-DNA in Pflanzenzelle - T-DNA integriert sich ins Genom und verursacht Herstellung von Enzymen zur Opinsynthese und Produktion der tumor-induzierenden Hormone: Auxin und Cytokinin

9. Welche Probleme traten bei der Verwendung von Agrobacterium tumefaciens zur gentechnischen Modifikation von Pflanzen auf und wie wurden diese gelöst?  -

Ti- Plasmid ist eine natürliche Methode für die Transformation von Pflanzen aber: Auxin- und Cytokinproduktion verhindert die Regeneration intakter Pflanzen Opin-Biosynthesegene nicht erwünscht, Belastung des Stoffwechsels Ti- Plasmid ist groß (> 200 kbps)  für genet. Modifikation ungeeignet Kein shuttle Vektor (es fehlt ein E.coli ori)

Entwickelte Ti- Plasmide: Anforderungen selektierbare Marker für Pflanzenzellen  E.coli ori (Funktion als shuttleVektor)  Multiple cloning site  rechte Grenze der T- DNA (linke Seite ist nicht essentiell)  Deletion der vir-Gene 2 Ansätze für entwickelte Ti- Plasmide: - binäres Vektorsystem  2 Plasmide (vir-Gene auf einem; T-DNA auf dem anderen) - co-integratives Vektorsystem  startet mit 2 Plasmiden, rekombinieren um ein einzelnes Plasmid zu erhalten  vir-Gene und T- DNA enden auf dem gleichen Plasmid

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10. Skizzieren Sie ein binäres Vektorsystem inklusive aller relevanten Regionen.

Zwei Plasmide: Binary Cloning Vector - contains both E. coli and A.tumefaciens ori - bacterial selectable marker - plant selectable marker - right border of T-DNA, but no vir genes - target gene Disarmed Ti plasmid - T-DNA deleted but contains the vir genes

11. Welche Methoden zur Transformation höherer Pflanzen kennen Sie? Beschreiben Sie diese stichwortartig inklusive der jeweiligen Vor-und Nachteile. • biologisch: Agrobakterien vermittelte Transformation Vorteile: - Bakterium macht die ganze Arbeit (natürlicher Prozess) - kein teures Equipment - wenige transgene Umlagerungen Nachteile: - funktioniert nicht gut für alle Arten und Genotypen (vor allem Gräser) - T- DNA hat limitierte Größe - Bakterielle Selektionsmarker auf dem T- DNA-Plasmid • mechanisch: 1) Particle Bombardement (GenGun) - ausfällen der DNA auf schmalen Wolfram oder Goldpartikeln - beschleunigen der Teilchen auf hohe Geschwindigkeiten um die Zelle und Gewebe zu beschießen - Hochspannungsimpulse zur Bildung von Poren; DNA schlüpft hinein - Vorteile: - weniger Beschränkung hinsichtlich der Art und des Genotyps (Anwendung für Hefe, Pilze, Algen, tierischen Zellen, Einkeimblättrigen (Mais, Reis, Weizen), Nachtschattengewächsen - kann verwendet werden bei Zellen mit Zellwand und jedem Gewebe - geeignet zur Transformation von Organellen  Plastide & Mitochondrien (Saccharomyces cerevisiae) - gleichzeitige Transformation von >10 versch. Genen auf versch. Plasmiden möglich - Nachteile: - Transformationseffizienz ist sehr gering - Übertragene DNA wird nicht immer stabil ins Pflanzengenom integriert - Regeneration des Gewebes beschwerlich und zeitaufwendig 2) Elektroporation : Anwendung von Strom bei Protoplasten  führt zur Depolarisation der Zellmembran und ermöglicht so die Aufnahme von DNA in die Zelle 3) Mikroinjektion: - direkte Injektion der DNA in den Zellkern der Protoplasten - Vorteil : erlaubt Transformation einzelner Zellen - Nachteil: Regeneration schwierig 4) Laser vermittelt

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• chemisch: PEG (Polyethylenglycol): Abbau von Pektin und Cellulose durch Enzyme (Pektinasen, Cellulase) -> Man erhält Protoplasten -> PEG macht die die Membran permeabel. Vorteil: einfach Nachteil: Zu hohe PEG-Konzentrationen führen zu Fusion von Protoplasten.

3. Selection of transgenic plants and tissue culture 1. Nennen Sie mindestens 4 Selektions- bzw. Reportergensysteme und erklären Sie kurz den jeweiligen Mechanismus. Aminoglycosid-Antibiotika (Resistenzgene) - Dominate Selektion über Antibiotika - z.B. Kanamycin, Streptomycin - Resistenz-Gene wie z.b nptII codieren für Aminoglycosid-3-Phosphotransferasen, die die Antibiotika durch Phosphorylierung inaktivieren - Selektion durch aus Plattierung der Pflanzen auf Antibiotika-haltigem Medium Herbizide (Resistenzgene) - Dominante Selektion mit Herbiziden - z.B. Phospinotricin (PPT) hemmt Glutaminsynthase in der Zelle - Resistenzgen codiert Phosphinotrictin-N-Acetyltransferase (PAT), dieses Enzym entgiftet PPT durch Acetylierung - Selektion wie bei Antibiotika Reporter-Gene - Ermöglichen optischen Nachweis der Genexpression - z.B gfp, rfp (grün und rot fluoreszierende Proteine) - z.B. luc – Enzym Luciferase produziert Licht beim zersetzen des Substrats Luciferin (aus Glühwürmchen) Gene die, die Metabolisierung bestimmter Stoffe ermöglichen - z.B. Phosphomannose-Isomerase aus E. coli - katalysiert die Umwandlung von Mannose-6-Phosphat zu Fructose-6-Phosphat zur Weiterverwendung bei der Glykolyse - Selektion dadurch das Mannose die einzige Kohlenstoffquelle im Regenerationsmedium ist 2. Aufgrund welcher Eigenschaft lassen sich aus somatischen Pflanzenzellen ganze intakte Pflanzen klonieren?  Totipotenz: die Zelle hat das Potential neuartige, ganze, pflanzenartige Stammzellen zu bilden

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3. Nennen Sie die einzelnen Schritte der Protoplastierung und Regeneration von Pflanzenzellen. Cytokine: Proteine, die das Wachstum und die Differenzierung von Zellen regulieren. Auxine: Wachstumsregulatoren (Phytohormone =`Pflanzenhormone`) mit multipler Wirkung auf Wachstumsund Differenzierungsprozesse bei Pflanzen.

4. Was versteht man unter somaklonaler Variation?  Regenerierte Pflanzen zeigen oft phänotypische Variation aufgrund von Unregelmäßigkeiten während der Mitose oder Mutationen

5. Nennen Sie mögliche Methoden der Regeneration von Pflanzen und beschreiben Sie kurz die wesentlichen Merkmale. • 1.Organogenese (indirekte und direkte) Bildung von Organen = entweder Sprossen oder Wurzeln abhängig von der Balance zwischen Auxin und Cytokinin und der Fähigkeit des Gewebes auf Phytohormone während der Kultivierung zu reagieren in vitro 2 Typen: indirekte Organogenese: - Bildung von Organen indirekt über die Kallus Phase - ideales System für die Selektion somaklonaler Variation mit dem gewünschtem Charakter und für die Massen- Multiplikation - genutzt für die Produktion von transgenen Pflanzen direkte Organogenese: - direkte Produktion von Knospen oder Sprossen aus dem Gewebe ohne Kallus-Stadium zu passieren - genutzt für die Produktion von transgenen Pflanzen und am meisten wichtig für die klonale Vermehrung (Bäume)

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• 2. Somatische Embryogenese -

nicht sexueller Entwicklungsprozess, welcher einen bipolaren Embryo mit einem geschlossenen Gefäßsystem aus somatischem Gewebe produziert stärkste Technik für massenhaft klonale Ausbreitung direkte Embryogenesis ist die bevorzugte Methode somatische Embryos können kryo-gespeichert werden als synthetische Samen somatische Embryos können auch direkt zu lebensfähigen Pflanzen keimen

6. Was sind die wesentlichen Komponenten von pflanzlichen Zellkulturmedien? -

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anorganische Salze organische Komponenten: - Saccharose (Kohlenhydrate- und Energiequelle) - Mineralien (Makro- und Mikronährstoffe) - Phytohormone als Wachstumsregulatoren - Aminosäuren (L- Gln) - Vitamine ( Thiamin, Nicotinsäure, Pyridoxin) - Zucker-Alkohol Myoinositol - teils komplexe Zusatzstoffe wie Kokosnusswasser Verfestigung des Mediums durch Zugabe von Agar oder Geliermitteln wie Gelrite

7. Nennen Sie 8 Phytohormone bzw. Phytohormongruppen sowie deren Wirkungen. Auxin - Zellteilung, Zellwachstum, Differenzierung von Gewebe, Wurzelwachstum Cytokinins - Zellteilung, Sprossenwachstum Gibberellins - Zellausdehnung Abscisinsäure (ABA) - Erkennen von Trockenheit und anderen Stressfaktoren: induzieren Gen-Transkription Gibberellinsäure (GA3) - Gegenspieler zu ABA, erforderlich um Samenruhe zu brechen Jasmonsäure (JA) - Erhöhung der Expression von pflanzlichen Abwehrgenen Ethylen - stimuliert das Reifen von Früchten, Wegfallen der Samenruhe, Blüten und Blattalterung Brassinosteroide (BR) - Einfluss auf Pflanzenwachstum und Entwicklung: Stammelongation, Blattentwicklung, Pollenwachstum, Differenzierung des Leitbündelsystems, Samenkeimung Stressantworten

8. Erläutern Sie inwieweit eine hormonabhängige Kallusdifferenzierung möglich ist und geben Sie Beispiele. Für die Organogenese muss das Verhältnis von Auxin zu Cytokinin stimmen generelle Regeln: - Auxin und Cytokin Kallusbildung - wenig Auxin im Verhältnis zu Cytokin  Sprossbildung - Viel Auxin im Verhältnis zu Cytokin  Wurzelbildung

Beispiel: - für ein Auxin -> Indol-3-essigsäure (IES) - für ein Cytokin -> Kinetin

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4. Input traits I: herbicide tolerance, insect and virus resistance 1) Was versteht man unter essentiellen Aminosäuren? Der Mensch benötigt diese AS, kann diese jedoch nicht selber herstellen -> über Pflanzliche Nahrung aufnehmen 2) Nennen Sie drei Beispiele für essentielle Aminosäuren. Valin, Methionin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Tryptophan, Threonin und Lysin 3) Was versteht man unter einem Breitbandherbizid? Breitbandherbizide (Totalherbizide) wirken gegen alle Pflanzen gleich. Sie unterscheiden nicht zwischen Nutzpflanzen und Wildkraut. 4) Warum ist die Verwendung von Breitbandherbiziden wie Glyphosat und Phosphinotricin vorteilhaft? -

Sie inhibieren Pflanzenenzyme, die in tierischen Organismen nicht vorkommen. Diese Substanzen sind daher für Mensch und Tier ungiftig Beide Substanzen werden rasch durch Bodenbakterien abgebaut

5) Was versteht man unter einem racemischen Gemisch?  Moleküle mit einem asymmetrischen C-Atom haben spiegelbildliche Struktur- Isomere (Chiralität). Bei Kohlenhydraten und AS werden D- und L-Formen unterschieden. Liegen beide Formen gleichzeitig vor spricht man von einem racemischen Gemisch (C-Atom mit 4 verschiedenen Substituenten -> asymetrisches C-Atom) 6) Welches Herbizid wird bei gleicher Konzentration wirksamer sein: Glufosinat oder Bialaph...