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UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GUIA Nº 2 COLORIMETRIA Y ESPECTROFOTOMETRÍA, DILUCIONES EN SERIE E INDEPENDIENTES PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO

_____________________________________________________________________ OBJETIVOS 1.

Obtener la curva espectral y la longitud de onda máxima de absorción en el espectro visible de un estándar que se encuentra mezclado con otro compuesto.

2.

Establecer los factores de dilución que se deben aplicar a un estándar para realizar una curva de calibración con tres diluciones en serie y proporcionales que inicien en un valor de absorbancia preestablecido.

3.

Elaborar curvas de calibración micro y macro con tres diluciones en serie y proporcionales que inicien en un valor de absorbancia preestablecido y corregirlas por mínimos cuadrados.

4.

Calcular los gramos presentes y el porcentaje de una muestra problema en una mezcla, a partir de la ley de Lambert y Beer y de los valores obtenidos por corrección por mínimos cuadrados de la curva de calibración.

5.

Establecer valores absortividad molar, específica y en L/μMol.cm de dos soluciones en el espectro visible y UV.

6.

Determinar la concentración en M/L, g/L, de una muestra problema en el espectro visible.

7.

Desarrollar destrezas en el laboratorio para realizar diluciones en serie e independientes aplicando proporciones y factores de dilución.

PREPARACION PREVIA 1.

Repase unidades de conversión de masa y volumen.

2.

Repase las formulas que establecen de manera rápida el factor de dilución.

3.

Repase los principios de la ley de Lambert-Beer.

4.

Realice un cuadro que relacione el color de la sustancia contra longitud de onda que absorbe a fin de delimitar el barrido.

5.

Investigue como se determina el factor W.

6.

Lea la metodología que aplicará durante la práctica de laboratorio.

1

MATERIALES 1 Gradilla

EQUIPOS 2 Espectrofotómetros

REACTIVOS 100 ml de solución de cloruro de Níquel o Cobalto, la concentración será indicada por el profesor.

8 Tubos de ensayo

4 Celdas para spectronic 21. 1 g Muestra problema (en estado sólido y en mezcla con un compuesto que no absorba en el espectro visible).

4 Pipetas de 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 2 Fotocolorimetros ml.

1. 5 ml de estándar que absorba en el espectro UV cercano, la concentración será indicada por el profesor

2 Beakers 50 ml y 250 ml.

4 Celdas de plástico para Fotocolorímetro.

1. 5 ml de muestra problema que absorba en el espectro UV cercano.

I Frasco lavador con agua destilada.

2 Celdas de cuarzo para espectrofotómetro UVVisible. 1 Espectrofotómetro UVVisible. 1 Estufa de calentamiento

1 CD (alumnos).

2 Hojas de papel milimetrado (alumnos). 1 Pkte de toallas secantes (grupo) 1 Balanza analítica. 1 Rollo papel aluminio (grupo)

5 Micropipetas 10 μL, 50 μL, 100 μL. 250μLy 1000 μL.

3 Cajas puntas blancas, amarillas y azules. 4 Tubos eppendorf de 1.5 ml.

PROCEDIMIENTO A. Curva espectral de cloruro níquel o cobalto. 1. Prepare un blanco de reactivos, que es una solución que contiene todos los reactivos a excepción del compuesto que va a medir para determinar su concentración. 2. Calibre el equipo. 3. Efectúe el barrido de la solución estándar delimitándolo de acuerdo a su color . 4. Registre en un CD el espectro y grafique la A contra  en nm. 5. Determine en la solución estándar el rango óptimo de absorción, su lambda máxima y su Absorbancia.

2

Tabla 1. Datos curva espectral cloruro de níquel o Cobalto. Grupo 1 Longitud de onda 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

%T

A

B. Curva calibración y diluciones independientes 1. Calcule los factores de dilución que debe aplicar a su estándar para elaborar una curva de calibración con 3 diluciones independientes y proporcionales que partan de un máximo de absorbancia de 062, 065, 0.72, 0.76, 0.82, 0.87, 0.92, 0.98 (el profesor asignará el valor a cada grupo), tenga en cuenta el valor de absorbancia obtenido en el numeral 5. 2. Rotule tres tubos de ensayo y elabore las 3 diluciones independientes. 3. Lea cada dilución en la  óptima hallada en el numeral 5, registre los valores del factor de dilución y A en la Tabla 2 de control de clase Anexo 2. 4. Calcule los valores de concentración de cada dilución en M/L, g/L y registre los valores en la Tabla 2 del Anexo 2. 5. Grafique la absorbancia de las tres diluciones (ordenada) contra su concentración en g/L (abscisa) sin hacer correcciones a los datos, luego corrija la curva de calibración por mínimos cuadrados

y grafique los valores obtenidos. Indique los valores de intercepto, pendiente y

coeficiente de correlación para la gráfica y procese los datos en la Tabla 2 del Anexo 2. 6. Estime la absortividad específica para la solución cloruro de níquel o cobalto despejando de la formula de Lambert-Beer y de los valores obtenidos al corregir por mínimos cuadrados la curva de calibración. 7. Calcule la concentración de la solución problema en g/L por despeje de los valores obtenidos al corregir por mínimos cuadrados la curva de calibración e interpole su valor en la grafica corregida en el numeral 5. 8. Determine en la muestra problema la cantidad en gramos y porcentaje de cloruro de níquel ó cobalto presentes en la mezcla.

3

Tabla 2. Datos curva calibración cloruro níquel o cobalto mediante diluciones independientes. Grupo

M/L Cloruro Niquel Lambda Estándar y Diluciones Máximo independiente donde leyó Abs 1 2 3 MP 1 a b r

Fd

g/L

M/L

g

X

X

MP

Abs Abs Observada Y Esperada

C. Curva de calibración y diluciones en serie 1. Calcule los factores de dilución que debe aplicar a su estándar de cloruro de níquel ó cobalto para elaborar una curva de calibración con 3 diluciones en serie y proporcionales donde la concentración máxima tenga una absorbancia de 1.1, 0.96, 0.85, 0.81, 0.75, 0.72, 0.67, 0,65 (el profesor le asignará uno de estos valores a cada grupo), prepare un volumen de 1.5 ml para cada una, en tubos eppendorf. 2. Lea cada dilución en el espectrofotómetro Perkin Elmer en la  óptima hallada en el numeral 5 de la curva espectral, registre los valores de factor de dilución, A y % T

en la Tabla 3 de

control de clase Anexo 2. 3. Calcule los valores de concentración de cada dilución en M/L y registre los valores en la Tabla 3 de control de clase Anexo 2. 4. Grafique la A de las tres diluciones contra su concentración en M/L sin hacer correcciones a los datos, luego corrija los datos de las curvas de calibración por mínimos cuadrados y grafique los valores obtenidos. Indique los valores de intercepto, pendiente y coeficiente de correlación para la gráfica y procese los datos en la Tabla 3 del Anexo 2. 5. Calcule la absortividad molar para la solución mediante el despeje de los valores obtenidos al corregir por mínimos cuadrados la curva de calibración. Tabla 3. Datos curva calibración cloruro níquel o cobalto mediante diluciones en serie. M/L Cloruro Níquel Lambda Estándar y Diluciones en Máximo Grupo serie Abs donde leyó 1 2 3 MP 1 a b r

Fd

g/L X

M/L X Abs Esperada

Abs Observada Y

4

D. Curva espectral de una solución desconocida Se tiene una solución W desconocida de peso molecular 709.4 g/Mol que presenta descomposición rápida con la luz, por lo tanto se debe proteger de esta con papel aluminio. La solución estándar que se entregará al grupo tiene una concentración conocida y no tiene color, cuando se realiza su barrido espectral presenta un pico de absorción a 260 nm debido a que contiene adenina, por lo tanto no tenga en cuenta este pico como su máximo absorción. 1. Calibre el equipo y efectúe el barrido de la solución estándar desconocida utilizando agua destilada como blanco de reactivos. 2. Procese los valores del barrido de la sustancia W en la Tabla 4 Anexo 2 y grave el espectro en un CD. 3. Grafique el espectro de absorción del estándar desconocido y determine el lambda máxima de absorción y su valor de absorbancia en esta longitud de onda. 4. Determine los mg del estándar que se tomaron para preparar 25 ml de esta solución 5. Elabore una curva de calibración con diluciones en serie y proporcionales. 6. Calcule los valores de absortividad molar, específica y en L/M.cm del estándar desconocido. 7. Establezca la concentración de la muestra problema en M. 8. Calcule el factor de dilución que se le realizó a la muestra problema si esta fue preparada a partir del estándar. 9. Investigue a que compuesto corresponde de acuerdo a su espectro de absorción. Tabla 4. Datos curva espectral sustancia desconocida.

Grupo

λ

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 RESULTADOS QUE DEBE PRESENTAR.

5

1. Anexe la curva espectral, y los valores de la Tabla 1 indicando la longitud de onda máxima de su estándar y el equipo que utilizó.

No olvide colocar las unidades de las variables

correspondientes. 2. Grafique las curvas de calibración y adjunte: los datos procesados en Tabla 2 del Anexo 2, factores de dilución aplicados, los valores de coeficiente de correlación, pendiente e intercepto obtenidos por mínimos cuadrados, los valores de absortividad en las unidades solicitadas, la concentración de la MP en Mol/L y g/L interpolando sobre la curva de calibración, despeje los Mol/L y g/L de la MP de de los valores de intercepto y pendiente obtenidos al corregir por mínimos cuadrados la curva de calibración (Y = a + b X) o de la formula de Lambert y Beer e indique los gramos presentes y el porcentaje de la muestra problema en la mezcla. 3. Grafique las curvas de calibración para las diluciones en serie y adjunte: los datos procesados en Tabla 3 del Anexo 2, factores de dilución realizados, los valores de coeficiente de correlación, pendiente e intercepto obtenidos por mínimos cuadrados y los valores de absortividad en las unidades solicitadas. 4. Indique los cálculos y factores de conversión que obtuvo para establecer los mg de muestra del estándar en 25 ml y para

la

muestra problema W la absortividad molar, específica,

L/µMol/cm, el factor de dilución que se aplicó, la concentración en µMol. 5.

Anexe la Tabla 4 y el espectro que identifica a que sustancia corresponde la muestra problema W analizada en el numeral D. sustente su respuesta con un espectro que halla sido reportado previamente en un artículo de aplicación en Bioquímica.

BIBLIOGRAFÍA PARA CONSULTAR 1.

BENDER, G. T. (1987). Métodos Instrumentales de Análisis en Química Clínica. Zaragoza: Acribia. p 37-85

6

ANEXO 2. Colorímetria y Espectrofotómetria Tabla 1 Datos curva espectral cloruro de níquel o cobalto A Grupo Longitud de %T A Grupo 4 onda 7 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15

Grupo 1 Longitud de onda 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

%T

Grupo 2 Longitud de onda 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

%T

A

Grupo 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Longitud de onda

%T

Grupo 3 Longitud de onda 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

%T

A

Grupo 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Longitud de onda

%T

Longitud de onda

%T

A

A

Grupo Longitud de 8 onda 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

%T

A

A

Grupo Longitud de 9 onda 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

%T

A

7

ANEXO 2. Colorímetria y Espectrofotómetria Tabla 2. Datos curva calibración Cloruro níquel o cobalto por diluciones independientes. Cloruro Niquel Abs Abs Grupo M/L Lambda g/L M/L g Diluciones Fd Esperad Observada Estándar y Máximo independientes a Y X X MP Abs donde leyó 1 2 3 1 MP 1 a b r 1 2 3 2 MP 2 a b r 1 2 3 3 MP 3 a b r 1 2 3 4 MP 4 a b r 1 2 3 MP 5 5 a b r 1 2 3 MP 6 6 a b r

8

Grupo

1

2

3

4

5

6

ANEXO 2. Colorímetria y Espectrofotómetria Tabla 3. Datos curva calibración Cloruro níquel o cobalto por diluciones en serie. Cloruro Niquel M/L Lambda g/L M/L Diluciones en Fd Estándar y Máximo Abs Esperada serie X X Abs donde leyó 1 2 3 MP 1 a b r 1 2 3 MP 2 a b r 1 2 3 MP 3 a b r 1 2 3 MP 4 a b r 1 2 3 MP 5 a b r 1 2 3 MP 6 a b r

9

Abs Observada Y

10

Grupo 1

Longitud de onda

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Grupo 2

Longitud de onda

ANEXO 2. Colorímetria y Espectrofotómetria Tabla 4 Datos curva espectral sustancia desconocida. A Grupo Longitud de A Grupo 7 4 onda 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 8 9 9 10 10 11 11 12 12 13 13 14 14 15 15 A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Grupo 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Longitud de onda

A

Grupo 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Longitud de onda

Grupo 6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Longitud de onda

A

Grupo8

Longitud de onda

A

Longitud de onda

A

Longitud de onda

A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 A

Grupo9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

11...