Practica 3. Acido Urico PDF

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UNIDAD DE CIENCIAS BÁSICAS ASIGNATURA DE BIOQUÍMICA GUÍA DE PRÁCTICAS SEGUNDO AÑO

PRACTICA 3. DETERMINACION DE ACIDO URICO EN SUERO

DETERMINACION DE ACIDO URICO EN SUERO

1. INTRODUCCION. La producción de urato es el mecanismo por el cual el organismo elimina el nitrógeno procedente de las bases nitrogenadas. Diariamente se producen unos 4,5 mmol; el 60% aproximadamente, es de origen endógeno, como el metabolismo del ADN y el 40% restante de origen exógeno, sobre todo procedente de los alimentos. La constante de disociación (pKa) del ácido úrico es de 5.57, de modo que, a pH fisiológico, este compuesto se encuentra fundamentalmente como urato. El 75% del urato producido se elimina por la orina y el resto pasa al aparato gastrointestinal. La concentración plasmática de urato depende de la edad y el sexo, también influyen la dieta y diversas variables genéticas y ambientales. La hiperuricemia se define como la existencia de concentraciones elevadas de urato en la sangre, la mayoría permanecen asintomáticos, pero algunos pueden desarrollar gota y alteraciones renales. Las causas de hiperuricemia puede ser un aumento de la producción de urato (aumento en la síntesis de novo de purinas o mayor catabolismo de las purinas) o por reducción de su eliminación renal. La gota es una enfermedad metabólica que se caracteriza por la precipitación de cristales de urato monosódico en los tejidos del organismo, llamados tofos que se producen en el líquido sinovial de las articulaciones y sobre los tejidos que las rodean y causan la aparición de artritis dolorosas.

2. OBJETIVO. Determinar la concentración de ácido úrico en suero, mediante un método espectrofotométrico. Comparar el valor de nuestra muestra sérica con los rangos de referencia de ácido úrico.

3. FUNDAMENTO DEL MÉTODO. La determinación del ácido úrico se fundamenta en la siguiente secuencia de reacciones enzimáticas:

Ácido úrico + 2 H2O +O2

Alantoína+ H2O2 + CO2

2H2O2 + 4-aminofenazona + 3,5-DHS

quinonimina (color)

El ácido úrico es oxidado por la enzima específica uricasa generándose alantoína y H2O2 (peróxido de hidrogeno), el cual en una reacción mediada por la enzima POD (peroxidasa),

reacciona

con

el

ácido

3,5-DHS

(3-5-Dicloro-2-Hidroxi-

Bencenosulfónico) y 4-AF (4-aminofenazona) produciéndose un compuesto coloreado (quinonimina), que se cuantifica por espectrofotometría.

3. EQUIPOS, MATERIALES, REACTIVOS Y MUESTRA. 3.1. EQUIPOS. Espectrofotómetro

Baño de agua

Cronometro

3.2. MATERIALES. Tubos de vidrio 13 x 100

Gradilla

Micropipetas

Tips de micropipetas

Recipiente de bioseguridad

Cubetas del espectrofotómetro

3.3. REACTIVOS. Kit para determinar ácido úrico. Contiene: Estándar: solución de ácido úrico 10 mg/dL. Reactivo A: sal sódica de 3,5 diclorohidroxibenceno sulfónico (DHS). Reactivo B: solución conteniendo buffer Good pH 7.8, 4-aminofenazona (4-AF), uricasa (UOD), peroxidasa (POD), y ferrocianuro de potasio

3.4. MUESTRA. Se debe obtener suero o plasma de la manera usual. Si se emplea plasma, se recomienda solo heparina como anticoagulante.

4. PROCEDIMIENTOS. 4.1. En tres tubos de ensayo rotulados como B, ST y M, colocar: Blanco

Estándar

Muestra

(B)

(ST)

(M)

Reactivo A (µL)

800

800

800

Reactivo B (µL)

200

200

200

Estándar (µL)

_

20

_

Suero (uL)

_

_

20

Reactivos

4.2. Mezclar e incubar durante 5 minutos en baño de agua a 37ºC.

4.3. Retirar y colocar en una cubeta y realizar la lectura en el espectrofotómetro a 505 nm, llevando el equipo a cero con el blanco.

4. Anotar los resultados de densidad óptica (DO) de los tubos ST y M.

5. CÁLCULO DE LOS RESULTADOS. Calcule la concentración de ácido úrico utilizando la siguiente formula: Ácido úrico en suero (mg/dL) =

DO muestra x Concentración estándar DO estándar

Ejemplo: DO muestra = 0.134 Concentración del estándar = 10 mg/dL DO estándar = 0.284 Ácido úrico en suero = 0.134 x 10 / 0.284 = 4.72 mg/dL

6. VALORES DE REFERENCIA. Mujeres: 2,0 a 6,0 mg/dL. Varones: 3,5 a 7,0 mg/dL. Para convertir las unidades al sistema internacional, se utiliza la siguiente formula: Ácido úrico (mg/dL) x 0.059 = Ácido úrico (mmol/L)

7. BIBLIOGRAFIA. Alvaro Gonzales Hernandez. Principios de bioquímica clínica y patología molecular. 3ª ed. Elsevier España. 2019 Gota. Rev. Fac. Med. (Méx.) [revista en la Internet]. 2014 Ago [citado 2020 Jun 23]; 57(4): 58-60. Disponible en: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S002617422014000400058&lng=es....