Práctica 4 - Cinética enzimática de la fosfatasa alcalina PDF

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La presente práctica expone la cinética enzimática de la enzima Fosfatasa alcalina, ofrece el perfil cinético de la enzima en diferentes escenarios como es modificación del pH, modificación de la temperatura, concentración de sustrato. Para finalmente realizar el cálculo de las velocidades máximas y...

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Universidad Nacional Autónoma de México. Facultad de Química. Bioquímica Experimental. Depto. De Bioquímica. Titulares: Dr. Ávila Chávez Euclides / Dra. Mendoza Rodríguez Carmen Adriana.

«Cinética enzimática de la fosfatasa alcalina» Por: Carrizosa Muñoz Cecilia1 / Chavira Tapia Juan Miguel2 / Hernández Benítez Luis Joshua3 / Torres Santander Fernando.4 Resumen. Introducción: Dado que la principal actividad de una enzima es catalizar una reacción, se debe conocer con precisión el qué y cómo determinados factores externos influyen en la enzima para que pueda realizar dicha acción de manera óptima. Los factores evaluados en el siguiente estudio son: temperatura, pH, concentración de sustrato y efecto de un inhibidor, además de un previo análisis cinético del progreso de la reacción enzimática estudiada. Se utiliza como enzima de estudio a la fosfatasa alcalina, fosfomonoesterasa que sirve como indicador en los procesos de pasteurización a nivel industrial. Objetivos: Determinar el efecto del pH, temperatura, la concentración del sustrato y la presencia de inhibidores sobre la enzima fosfatasa alcalina, asi como determinar sus parámetros cinéticos KM y vmax. Material y método: Se utiliza a la enzima fosfatasa alcalina la cual posee como sustrato al pnitrofenilfosfato, para producir p-nitrofenol, el cual se cuantificará en los ensayos de temperatura y efecto de la concentración tanto de sustrato como inhibidor por espectrofotometría visible.

Resultados y discusión: De acuerdo a los ensayos realizados, el tiempo que se consideró trabajar la enzima fosfatasa alcalina fue de 5 minutos, ya que en este periodo la generación del producto sigue un comportamiento lineal. Bajo este término, la enzima se incubó por 5 minutos en todo estudio realizado, por lo que el pH óptimo de trabajo de la enzima es de 10, siendo su KM=1.04x10-4 μmol/μL cuando no hay inhibidor y KM=2.71x10-3 μmol/μL cuando se evalúa la actividad enzimática en presencia de un inhibidor, teniendo en cuenta el aumento en Km y la similitud del inhibidor con el sustrato, se puede hablar de una inhibición competitiva mixta debido a los cambios en la velocidad máxima obtenidos. Conclusiones: El estudio de los factores que afectan a la actividad enzimática de una enzima, además de la determinación de sus parámetros cinéticos permiten que en la industria o en la investigación se pueda aprovechar la capacidad catalítica de en este caso la fosfatasa alcalina. INTRODUCCIÓN. La fosfatasa alcalina (FA, ALP) (Ortofosfórico monoéster fosfohidrolasa EC 3.1.3.1.) es una fosfomonoesterasa ligada a la membrana celular,

Contacto. Equipo 5: 1 [email protected] 2 [email protected] 3 [email protected] 4 [email protected]

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constituida por un grupo de isoenzimas que catalizan la liberación de fosfato de ésteres monofosfóricos a pH alcalino. Las fosfomonoesterasas que no tienen sustrato específico son clasificadas como fosfatasa alcalina o ácida según el pH óptimo al que desarrollan su actividad. Mientras que la fosfatasa ácida funciona mejor a pH cercano a 5.00, la fosfatasa alcalina tiene un pH óptimo próximo a 9.00. La FA, involucrada en el transporte de metabolitos a través de las membranas celulares, se encuentra en casi todos los tejidos del cuerpo, pero es mayor su presencia en el hígado, las vías biliares y los huesos. En el adulto, la fuente principal de FA es el hígado (fracción termoestable) mientras que el resto proviene casi en su totalidad del hueso (fracción termolábil). Las fosfatasas alcalinas de hueso, hígado y riñón comparten una estructura proteica común, codificada por el mismo gen y difieren en su contenido en hidratos de carbono. La vida media de la isoenzima hepática es 3 días. La FA sérica normal está formada por varias isoenzimas diferentes procedentes de hígado, hueso placenta y menos a menudo, de intestino delgado, las cuales pueden ser cuantificadas por separado si es necesario para determinar la fuente de origen de una patología. Se realiza en el contexto de otras pruebas hepáticas GOT: transaminasa glutámicooxalacética, GPT: transaminasa glutámico-pirúvica, bilirrubina, gamma-GT: gamma-Glutamiltranspeptidasa para evaluar problemas o alteraciones del hígado y en otros casos para diagnóstico y seguimiento de otras patologías. Es muy sensible, sobre todo, en problemas de obstrucción de las vías biliares. Es la enzima más sensible a los problemas hepáticos producidos por tumores metastásicos. Suele asociarse a la elevación de la gamma-GT, excepto

que en los problemas óseos solo se eleva la fosfatasa alcalina. La fosfatasa alcalina es varias veces más alta en niños y adolescentes, alcanzando las actividades del adulto aproximadamente a los 25 años. Los valores son ligeramente mayores en hombres que en mujeres hasta los últimos años de vida. En los hombres adultos, los límites superiores del intervalo de referencia no cambian con la edad, mientras que en las mujeres los límites superiores del intervalo de referencia aumentan con la menopausia. HIPÓTESIS. La cinética enzimática de la fosfatasa alcalina se verá afectada por distintos factores como el pH, la temperatura, la concentración del sustrato y la presencia de inhibidores. OBJETIVOS. Analizar las respuestas que se observan en la velocidad de la reacción enzimática en función de diferentes factores como el progreso de la reacción, el pH, la temperatura, la concentración de sustrato e inhibidores. Así mismo establecer las condiciones de ensayo para determinar la actividad enzimática. MATERIAL Y MÉTODOS. La parte experimental de esta práctica se llevó a cabo siguiendo las instrucciones del protocolo elaborado por la M. en C. Luz del Carmen Castellanos Román el cual se encuentra disponible en la página del departamento de audiovisuales (http://depa.fquim.unam.mx) de la Facultad de Química de la UNAM.

RESULTADOS. 0.6 0.5

A 415nm

0.4 y = 0.0099x - 0.0009 R² = 0.9973

0.3 0.2 0.1 0 0

10

20

30

p-nitrofenol (nmol)

40

50

60

Figura 1. Curva de calibración de pnitrofenol para la determinación posterior de la actividad de la fosfatasa alcalina en diferentes ensayos.

2

40

p-nitrofenol (nmol)

35 30 25 20 y = 1.2439x - 0.3492 R² = 0.9991

15 10 5 0 0

5

10

15

20

25

30

Tiempo (min)

Figura 2. Progreso de la reacción enzimática para la enzima fosfatasa alcalina.

0.16 0.14

p-nitrofenol (nmol)

0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 6

7

8

9

10

11

12

pH

Figura 3. Efecto del pH sobre la reacción enzimática llevada a cabo por la fosfatasa alcalina para la producción de pnitrofenol. Se observa un máximo a pH 10, indicando ser el pH óptimo de trabajo de la enzima.

0.03 0.025

A 415 nm

0.02 0.015 0.01 0.005 0 0

10

20

30

40

-0.005 -0.01

Temperatura (°C)

50

60

70

80

Figura 4. Efecto de la temperatura sobre la reacción enzimática llevada a cabo por la fosfatasa alcalina

3

1/T (K-1) 0 0.003 -0.2

0.00305

0.0031

0.00315

0.0032

0.00325

0.0033

0.00335

0.0034

Log Velocidad

-0.4 -0.6 -0.8

y = -10156x + 32.653 R² = 0.8679

-1 -1.2 -1.4

Figura 5. Relación de Arrhenius para la obtención de la energía de activación para la fosfatasa alcalina.

-1.6 -1.8 Desnaturalización enzimática

Tramo ascendente

0.0025 0.002

0.001 0.0005 0 -0.0005

0

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

0.0005

-0.001 -0.0015 -0.002

[p-nitrofenilfosfato] [μmol/μL] Efecto de un inhibidor

0.0006

Figura 6. Efecto de la concentración de sustrato e inhibidor en la actividad enzimática de fosfatasa alcalina. Nótese que en presencia de un inhibidor, la actividad de la enzima disminuye.

Efecto de la concentración de sustrato

1600 1400 1200

1/v [min/μmol]

V [μmol/min]

0.0015

1000 800 600 400 200 0

-10000

-5000

0

5000

1/[p-nitrofenilfosfato] [μL/μmol] Sin inhibidor

10000

Figura 7. Gráfica de Lineweaver-Burk para la determinación de parámetros cinéticos KM y Vmax, con lo cual permite un análisis sobre el tipo de inhibición que experimenta la fosfatasa alcalina.

Con inhibidor

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Tomando en cuenta las ecuaciones de las rectas en comience la reacción en las condiciones impuestas la Figura 7, se obtienen los siguientes datos: (condiciones óptimas). Ensayo Parámetro Sin inhibidor Con inhibidor

KM[μmol/μL] -4

1.04x10 2.71x10-3

Vmax[μmol/min] 0.0025 0.0226

DISCUSIÓN. Los ensayos enzimáticos miden la velocidad con la que una enzima trabaja, y se determina el descenso de la concentración de sustrato o la aparición del producto en cuestión. En ocasiones, los ensayos enzimáticos utilizan sustratos coloridos o productos coloridos para que así, las concentraciones de ambos puedan ser medidas mediante el Ilustración 1. Reacción realizada en el desarrollo experimental. uso de un espectrofotómetro. Los tipos de ensayos Conversión del p-nitrofenilfosfato a p-nitrofenol por la FA. enzimáticos utilizados en esta práctica son del tipo discontinuo, en los cuáles, la reacción es detenida después de un periodo fijo de tiempo previamente determinado. - Progreso de la reacción enzimática. Además, para poder tener este tiempo fijo, es necesario detener la reacción catalizada por la enzima, para ello, se puede contar con la adición de un agente desnaturalizante, como el calor o algún cambio rápido de pH, que desactivará a la enzima por un cambio en su estructura química. Por ello, en esta práctica se adicionó NaOH como agente desnaturalizante y se detuvo la reacción a un tiempo fijo (5 minutos) para medir la actividad enzimática.

El progreso de la reacción enzimática es el parámetro que se utiliza para observar la cantidad de producto que una enzima va generando a través del tiempo o en contraste observar la desaparición del sustrato. Para nuestro ensayo en la Figura 2 es posible observar como al aumentar el tiempo la concentración de producto (p-nitrofenol) también aumenta, por lo que la relación es directamente proporcional. Esta relación no se cumple por un tiempo indeterminado, sólo ocurre en una parte del progreso de la reacción enzimática, a lo que se le llama fase de velocidad inicial, esta velocidad inicial ocurre dentro de los primeros minutos de la reacción, generalmente esta relación se mantiene mientras el consumo del sustrato no vaya más allá del 5 % de la concentración inicial. (Nelson, 2004).

De igual manera, para evaluar las distintas condiciones que interfieren en la actividad de la enzima alcalina fosfatasa, se utilizó un sustrato no natural de la enzima, pero que posee propiedades que lo hacen particularmente útil para este ensayo. Una de estas condiciones favorables para el uso de la Fosfatasa Alcalina es la utilización de pnitrofenilfosfato ya que este es un reactivo incoloro, pero al ser utilizado por la enzima se convierte en p-nitrofenol, un El progreso de la reacción enzimática es reactivo de color amarillo. Aquellos sustratos que cambian extremadamente útil para determinar el tiempo en el cual la de color cuando son utilizados por una enzima son llamados reacción enzimática tiene esta relación lineal, para el caso “sustratos cromogénicos”. de la Figura 2 (progreso de la reacción enzimática) notamos Se observó que la absorbancia incrementa que la linealidad se mantiene por lo que para no salir de la proporcionalmente al aumento de la producción del p- fase de la velocidad inicial que es donde debemos nitrofenol. Pero para la cuantificación del p-nitrofenol fue enfocarnos en todos los estudios cinéticos se localizó en los necesaria la elaboración de una curva de calibración. El primeros cinco minutos de reacción. orden de adición de reactivos es de suma importancia en Una vez que la reacción enzimática deja de seguir la todos los experimentos, donde se establece el medio donde linealidad se produce una meseta, la cual se debe al se llevará a cabo la reacción. La preincubación sirve para decremento de la concentración del sustrato, establecer la temperatura óptima del medio de reacción (se desnaturalización de la enzima e incluso su inhibición. utilizó a 37°C) para después colocar la enzima y que (Lehninger, 2005).

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Efecto del pH

enzimática de la fosfatasa alcalina a distintas temperaturas. Como se puede observar en la Figura 3 los resultados concuerdan con lo reportando en la literatura ya que se observa la máxima tasa de actividad enzimática a 37°C lo cual nos indica que esta temperatura es aquella en donde la enzima trabaja de manera óptima.

Los cambios de pH del medio donde se encuentra la enzima pueden alterar o inhibir a la enzima para que catalice una reacción. El cambio de pH afecta a las fuerzas repulsivas y atractivas, tanto polares como no polares, alterando de esta manera la estructura de la enzima así En relación a temperaturas menores a la óptima se como el del sitio activo de ésta, impidiendo que el sustrato puede observar que la actividad enzimática si bien no es se asocie a este. De acuerdo a Mobley & Cols. (1984), el nula es mucho menor, esto se debe a que la enzima a bajas pH óptimo de la fosfatasa alcalina es de 9.0. temperaturas se inactiva por lo que se observa que la tasa de actividad enzimática disminuye de manera paulatina; La enzima es muy estable en un rango de pH de 7.5 a por el contrario cuando la enzima se lleva a temperaturas 9.5, encontrándose el pH óptimo de la enzima en valores de altas, es posible notar que la tasa de actividad disminuye de pH de 8-10. manera más abrupta, esto se debe a que la enzima se Los resultados obtenidos en este experimento nos desnaturaliza y pierde totalmente la capacidad de catalizar indican un pH óptimo de la enzima, donde se observó un la reacción para la que está diseñada. pico de actividad a un valor aproximado de pH=10. Esto Cuando hablamos de temperatura es imprescindible nos indica que posiblemente el pH óptimo se pudo haber mencionar el término energía, en esencia la función de una visto alterado principalmente por las altas concentraciones enzima es disminuir la energía de activación de una de sustrato utilizadas, pero esenciales para la técnica. reacción para que esta pueda suceder más rápido, la energía de activación enzimática depende de la temperatura a la Se observó una especie de campana, lo que nos indica cual la reacción se lleva a cabo. De acuerdo con la Figura 5 que hay un pH específico donde la actividad de la enzima y utilizando la relación de Arrhenius se obtiene que la es máxima, donde observamos la mayor absorbancia por energía de activación para la fosfatasa alcalina es de 1.22 mayor producción de sustrato en producto. La parte con kJ/mol este valor no es muy distante del reportado por pendiente positiva y negativa nos indican que a esos valores Abubakar, 2013 que es de 1.44 kJ/mol las diferencias en el de pH la enzima si posee actividad, pero no es tan eficiente valor se pueden deber a muchos factores como lo es el o la transformación que realiza no es la máxima que la control exacto de las temperaturas durante todo el experimento, el tiempo real que la reacción se llevó a cabo, enzima puede ofrecer. entre algunos otros. Sin embargo los valores no son significativamente muy diferentes por lo que la energía de - Efecto de la temperatura activación es aceptable, cabe recalcar que este valor además Todas las enzimas tienen un rango de temperatura de de las condiciones de experimentación también depende del actividad óptima. Fuera de este rango, se puede decir que la estado de la enzima al momento del experimento. enzima es inactiva o que está totalmente “inhibida”. Esto ocurre porque, al aumentar la temperatura, se va aportando - Efecto de la [Sustrato] y de [Inhibidor] una mayor cantidad de energía suficiente para romper algunas de las interacciones de atracción intramoleculares Se ha demostrado experimentalmente que si la entre grupos polares, así como a las fuerzas hidrofóbicas concentración de la enzima es mantenida constante, y la entre grupos no polares con la estructura de la proteína. concentración del sustrato es incrementada gradualmente, Cuando estas fuerzas se alteran, causa un cambio en las la velocidad de la reacción incrementará hasta que se estructuras terciarias y secundarias de la estructura de la alcance un máximo (Figura 6). Después de este punto, los proteína, y de esta manera alterar la conformación del sitio incrementos en la concentración del sustrato no activo, provocando que este sea incapaz de llevar a cabo la incrementarán la velocidad, dado que la relación de reacción que debía catalizar. concentración enzima-sustrato es 1:1, por lo cual la enzima De acuerdo a Mobley & Cols. (1984), la temperatura sigue una cinética de saturación descrita por la conocida óptima de la actividad de la Fosfatasa Alcalina es de 37°C ecuación de michaelis-menten: lo cual se pudo comprobar mediante el ensayo de temperatura, ya que en éste se evaluó la actividad

𝑉0 =

𝑉𝑚𝑎𝑥 [𝑆] 𝐾𝑀 + [𝑆]

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Dicha ecuación maneja dos parámetros importantes en completo a la enzima antes de catalizar la reacción o bien el estudio de cualquier enzima, KM y Vmax. debido a que se necesita de agua para llevar a cabo la reacción de hidrólisis, al diminuir este reactivo la enzima Al saber que KM, es un factor que indica la afinidad de no pudo catalizar la reacción. la enzima por su sustrato (entre más pequeño sea su valor, hay más afinidad de la enzima por su sustrato), tenemos que Para calcular KM (intrínseco de fosfatasa alcalina) y se ve afectado en presencia de un inhibidor, la función del Vmax se toma en cuenta una forma alterna de la ecuación de molibdato de sodio (ion que puede formar campos Michaelis-Menten, una gráfica de dobles recíprocos expandidos de coordinación) como inhibidor implica una “Lineweaver-Burk” como la que se muestra en la Figura 7. saturación de la enzima lo cual ocasiona que la fosfatasa Dichas gráficas se trazaron tomando en cuenta los tubos 1 alcalina no esté llevando a cabo su reacción normal al 4 del ambos ensayos por trazar una tendencia catalítica; por lo tanto KM aumenta como se observa aparentemente proporcional entre la concentración de pclaramente en la Figura 6. Nótese que las velocidades nitrofenilfosfato y la velocidad de reacción; una vez iniciales no se ven afectadas en gran medida, en el rango de realizado los cálculos se obtuvieron que a pesar de concentraciones de 1.6x10-4 a 3x10-4 de p-nitrofenilfosfato, aumentar el valor de KM, es decir, la afinidad de la fosfatasa los valores de Vmax. permanecen casi iguales en ambos alcalina por el p-nitrofenilfosfato se redujo por la presencia ensayos, por tanto podemos concluir que el modo de de un inhibidor que ocupa el sitio activo de la enzima, con inhibición del molibdato de sodio sobre la fosfatasa alcalina lo cual no se lleva a cabo la catálisis, las velocidades es de tipo competitivo. también cambiaron, esto no asegura una inhibición totalmente competitiva o bien, pudo suceder que el tiempo Los inhibidores competitivos son moléculas que tienen de incubación fue demasiado largo como para no solamente una similitud estructural y química con el sustrato de la cuantificar la producción del p-nitrofenol. enzima, por lo que se pueden unir al sitio activo. Sin embargo, debido a que el inhibidor no es idéntico al CONCLUSIONES. sustrato, l...