Practica 5 Espectrofotometria PDF

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PRACTICA 5 DE ESPECTROFOTOMETRIA...

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PRACTICA Nº 5 ESPECTROFOTOMETRIA RELACIÓN DE EXPERIMENTOS: 1. Cáculo del factor de calibración y construcción de una curva de calibración. 2. Determinación del espectro de absorción del anaranjado de metilo. 3. Determinación colorimétrica de colesterol en suero sanguineo OBJETIVOS: 1. Calcular la concentración de una sustancia presente en solución aplicando la ley de Beer-Lambert, mediante un método fotocolorimétrico. 2. Comprender los conceptos de factor de calibración y curva de calibración en el uso de los métodos fotocolorimétricos. 3. Conocer el fundamento de los métodos fotocolorimétricos. 4. Determinar el espectro de absorción de una sustancia y reconocer su importancia. INTRODUCCION: Este es un método muy ampliamente usado en bioquímica y análisis de laboratorio para determinar la concentración de una sustancia presente en solución. Se le utiliza para medir la concentración de una sustancia presente en un líquido biológico ( sangre total, suero, plasma, orina, etc. ) También es útil para la cuantificación de una sustancia presente en un tejido, sea por examen en el tejido de una actividad enzimática por ejemplo o por previa extracción de la sustancia a partir del tejido y su posterior determinación. También pueden ser empleados estos métodos para la identificación de una sustancia o examinar algunas propiedades de ella a través de la modificación de su espectro de absorción por ejemplo. Así, hay otros usos que los iremos viendo conforme avancemos en desarrollo del curso. Como se ha visto en la parte teórica, estos métodos hacen uso del espectro electromagnético como fuente de radiación para hacer las mediciones. La espectrofotometría utiliza como fuente, luz visible o del espectro ultravioleta (UV) empleando los aparatos llamados Espectrofotómetros; en tanto que la fotocolorimetría que 45

vendría a ser una parte de la espectrofotometría, solamente utiliza luz del espectro visible (400 a 800 nm), para hacer las determinaciones, empleando el aparato llamado fotocolorímetro el cual emplea filtros de color para seleccionar un intervalo de longitud de onda correspondiente al filtro usado. Tanto a la espectrofotometría

como a la

fotocolorimetría, en conjunto, se les da el nombre de fotometría, pero en la actualidad este término ya casi no se usa. En la presente práctica sólo usaremos el fotocolorímetro

Fuente de luz

Filtro

Muestra

Fotocelda

Registro

Figura Nº 1. 1.- Componentes de un fotocolorímetro Los métodos espectrofotométricos y fotocolorimétricos se aplican para medir la fuerza transmisora de luz de una solución, con el objeto de determinar la concentración de una sustancia presente en dicha solución, que es la que absorbe la luz. Si la solución de por sí ya tiene color, lo cual no sucede frecuentemente, se puede comparar la absorbancia mostrada por la sustancia presente en solución, con la que producen soluciones de la misma sustancia; pero, de concentración conocida, para así poder determinar la concentración de esta sustancia en aquella solución en donde no se le conocía. Si la sustancia presente en solución no tiene color, que es lo que sucede más frecuentemente, habrá que hacerla reaccionar con ciertos reactivos a fin de que se produzca un determinado color, cuya absorbancia pueda ser medida en el fotocolorímetro, comparando su absorbancia con aquellos que producen otras soluciones de la misma sustancia pero de concentración conocida ( soluciones estándar ), mediante la aplicación de la ley de Beer-Lambert. Los espectrofotómetros y los fotocolorímetros miden pues kla absorbancia de las soluciones que tiene una sustancia cuya concentración se desea medir. Pero, como ya se ha dicho antes, los fotocolorímetros solamente usan luz visible y se emplea filtros para seleccionar haces de longitud de onda, correspondientes al filtro que se se usa, ( así, el filtro 46

azul deja pasar haces de longitud de onda entre 400 a 465 nm; el filtro verde entre 500 a 570 nm; y el filtro rojo entre 640 a 700 nm). En tanto que los espectrofotómetros emplean como fuente de luz tanto la visible como la UV, y se puede seleccionar una determinada longitud de onda mediante el uso de un prisma y colimador; por lo tanto, en las mediciones de absorbancia se emplea un haz de longitud de onda deseada. Los fotocolorímetros se usarán para sustancias que absorben luz visible o UV. En el curso de Bioquímica, en la mayor parte de los casos utilizaremos la expresión práctica de la ley de Beer-Lambert, que como ya se ha visto en la parte teórica, es: Abst

Cst

----------- = ----------Abx

(Ecuación 1)

Cx

Es decir las absorbancias son directamente proporcionales a las concentraciones. Resulta entonces que en cualquier método fotocolorimétrico, en la mayor parte de los casos, se trabajará con tres tipos de soluciones. La muestra que contiene la sustancia cuya concentración se desea medir (Cx) y cuya absorbancia se mide en el fotocolorímetro (Abx); la solución estándar, cuya concentración de la sustancia es conocida (Cst, y cuya absorbancia tambien se conocerá ya que se la medirá en el fotocolorímetro (Abst); finalmente tenemos la solución blanco, que generalmente tiene el disolvente puro y/o los reactivos, pero, sin la sustancia que se desea medir, su absorbancia tambien la medimos en el fotocolorímetro. Estos tres tipos de soluciones, se tratan siempre de igual manera y con los mismos reactivos. Antes de aplicar la ecuación 1, hay que de restar la lectura del blanco a Abx y a Abst (Absorbancias netas) y con estos datos recien podemos proceder a calcular la concentración Cx, según la ecuación 1: Cst x Abx ---------------------- = Cx Abst

(Ecuación 2)

El valor Cst / Abst, se llama factor de calibración ( Fc ); así, la ecuación 2 quedaría como: Cx = Fc x

Abx

(Ecuación 3)

En una buena parte de los métodos fotocolorimétricos que se usan para determinar una sustancia, se emplea, no una solución estándar sino varias, esto con el objeto de dar mayor precisión a la medida; por lo tanto antes de emplear la ecuación 3, se deberá obtener un factor

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de calibración para cada solución estándar, luego sacar el promedio y recien emplearlo en la ecuación 3. Otro método que con frecuencia se usa para obtener Cx , es mediante la curva de calibración. Esto consiste en hacer un ploteo de las concentraciones de los estándar en el eje “X” , frente a sus absorbancias ( usar siempre absorbancias netas ) en el eje “Y”. Con esta gráfica se puede extrapolar, usando la absorbancia neta de la muestra X, para ver cual será su concentración. Con frecuencia, para hallar la concentración de la sustancia en g % o mg % debemos hacer operaciones adicionales. Generalmente se usa una muy pequeña cantidad de muestra para hacer la reacción de coloración y determinar su absorbancia; luego, la concentración encontrada según los métodos indicados, corresponde a la cantidad de muestra empleada, para hacer la reacción de coloración, por lo que, para encontra la concentración de la sustancia en g o mg %, que son las concentraciones como normalmente se expresan, deberemos hacer una regla de tres simple para encontra dicha concentración en 100 ml de solución o muestra. Esto se comprenderá mejor cuando hagamos un ejemplo de la utilización de un método fotocolorimétrico para la determinación de una sustancia, como lo proponemos en uno de los experimentos que se indican más abajo. Alternativamente, es posible hallar resultados directamente en porcentaje (g ó mg %), si se calcula un factor de calibración porcentual; es decir , que el Fc simple encontrado previamente, se lo corrige para hacer la reacción de coloración; luego, al multiplicar este factor porcentual por la absorbancia neta de la muestra X, tendremos el resultado directamente en g % ó mg %. Para el caso de la curva de calibración, podemos calcular las concentraciones de los estándares en g % ó mg %, así que se plotea absorbancias frente a concentraciones de los estánda en g % ó mg %, luego la absorbancia neta de la muestra X se extrapolará en la gráfica, dandonos el resultado directamente en g % ó mg %, con lo que los cáculos se simplifican. EXPERIMENTO 1 . FACTOR DE CALIBRACION Y CONSTRUCCION DE LA CURVA DE CALIBRACION. Reactivos: -

Solución de anaranjado de metilo a 1 mg %.

-

Solución de anaranjado de metilo de concentración desconocida ( Muestra X ). 48

En este experimento se trata de hallar la concentración de una solución de Anaranjado de Metilo (Muestra X). Se tendrá cinco concentraciones diferentes de Anaranjado de Metilo (soluciones Estándar). Procedimiento. Por el método del Factor de calibración. En siete tubos de ensayo medir lo siguiente ( en ml ): Tubo Nº

REACTIVOS 1

2

3

4

5

Muestra

Blanco

Anaranjado de Metilo 1 mg %

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

-----

-----

Agua destilada

8.0

6.0

4.0

2.0

-----

-----

10.0

Sol. de A. Metilo de concentr. desconoc.

-----

-----

-----

-----

-----

10.0

-----

4

5

Muestra

Blanco

Mezclar bien y leer en el fotocolorímetro con filtro azul. Completar el siguiente cuadro: 1

2

3

Absorbancia o D.O Absorbancia Neta

------

Concentración en mg % de los estándar de A. M. Factor de Calibración Concentr. de la muestra D. O : Densidad Optica,

------

------

------

------

------

------

------

------

-----------

A. M. : Anaranjado de Metilo

Por lo tanto el factor de calibración será de: _________________ La concentración de la muestra X de Anaranjado de Metilo será de: ____________ mg % Procedimiento: Por el método de la Curva de Calibración. Con los datos de las absorbancias netas de los tubos del 1 al 5 y sus respectivas concentraciones, construir la curva de calibración para el anaranjado de metilo. Usar papel milimetrado haciendo en cada eje las escalas adecuadas, en el eje X colocar concentraciones de Anaranjado de Metilo y en el eje Y las absorbancias o Densidades Ópticas netas. Trazar la línea tomando los puntos medios. Colocar o pegar la gráfica en el siguiente espacio:

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Figura Nº 1.2 .- Curva de calibración para el anaranjado de metilo La concentración de la muestra”x” de anaranjado de Metilo, según la curva de calibración será de: ______________ mg %. Nota (1): Hay fotocolorímetros que nos dan la absorbancia o densidad óptica (D.O) directamente. Otros aparatos como los fotocolorímetros Klett dan en unidades Klett (UK), que son unidades proporcionales a la densidad óptica. Para convertir D.O. en U.K., multiplicar la D.O. por 500; en tanto que para convertir U.K. en D.O., multiplicar U.K. por 0.002 ó dividir la U.K. entre 500. Nota (2): Si por alguna razón no está operativo el fotocolorímetro del laboratorio se puede trabajar con las siguientes D.O. : Tubo 1: 0.320; tubo 2: 0.460; Tubo 3: 0.650; Tubo 4: 0.840; Tubo 5: 0.950; Tubo 6 (Muestra x): 0.720 y tubo 7 (blanco): 0.00 Nota (3): En el caso de no disponerse de soluciones de Anaranjado de Metilo, se puede trabajar con una de Bicromato de Potasio a 0.1 g %. Procediéndose en forma semejante a lo señalado en la tabla ya indicada para el Anaranjado de Metilo.

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EXPERIMENTO 2. DETERMINACION DEL ESPECTRO DE ABSORCION DEL ANARANJADO DE METILO. La determinación de un espectro de absorción siempre debe hacerse usando un aparato que pueda seleccionar una longitud de onda determinada. Como se sabe, para determinar un espectro de absorción de una sustancia, hay que medir la D.O. en varias longitudes de onda determinadas, una por una, y luego hacer un gráfico donde se plotea las D.O. ( en el eje Y) frente a las longitudes de onda ( en el eje X ). Cada sustancia en solución tiene su espectro de absorción característico y así podemos identificar de que sustancia se trata. Procedimiento: De la solución de Anaranjado de Metilo del experimento 1, que tiene una concentración de 1 mg %, hacer una dilución 1: 2.5 con agua destilada. Tomar un fotocolorímetro o espectrofotómetro que seleccione longitudes de onda determinadas, ajustar a 100 % de transmisión usando un tubo con agua destilada, y luego medir la absorbancia de la solución diluida de A. de Metilo a las longitudes de onda de 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 550 nm. En el caso de no disponer del aparato indicado, usar las siguientes lecturas: Longitud de

Absorbancia

onda (nm)

(D.O)

400

0.290

420

0.320

440

0.380

460

0.420

480

0.375

500

0.200

520

0.180

550

0.090

Construir el espectro de absorción de Anaranjado de Metilo en una hoja de papel milimetrado, colocando en el eje X las longitudes de onda y en el eje Y las absorbancias Usar el espacio siguiente para pegar su gráfico 51

Figura Nº 1.3.- Espectro de absorción de luz del Anaranjado de Metilo Cuál es la longitud de onda con la que se obtiene mayor absorbancia para el Anaranjado de Metilo? ___________

INTERROGANTES BIOQUIMICAS. 1. Que es transmitancia y que es Absorbancia. Qué relación existe entre estos términos? _________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ 2. Que entiende Ud. Por espectro de absorción de una sustancia? _________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ 3. Que es una curva de calibración y que es Factor de calibración. Como se las obtiene? _________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ 52

_______________________________________________________________________ 4. Si una sustancia en solución tiene una transmitancia de 48 cuál será su absorbancia? Respuesta: ……………………………….

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