Practica 5 - Métodos de siembra y aislamiento bacteriano ( Micro PRAC) PDF

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UNIDAD ACADÉMICA DE CIENCIAS BÁSICAS GUÍA DE PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA SEGUNDO AÑO

SESIÓN V MÉTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO BACTERIANO

2020-2

1

I.

INTRODUCCIÓN

En Microbiología se entiende como siembra al proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos (inóculo), de un cultivo crecido a un medio nutritivo para su crecimiento. Todo este proceso hay que llevarlo a cabo con instrumentos y medios previamente esterilizados y siguiendo las instrucciones de los profesores de práctica. La principal advertencia consiste en trabajar siempre próximos a la llama del mechero que, debido a las corrientes de convección verticales que genera es capaz de crear un ambiente estéril en la zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama. Para realizar un cultivo de microorganismos es necesario que el número de células bacterianas (inóculo) sea transferido (inoculado) a un medio de cultivo estéril. Al querer aislar una especie en particular a partir de una mezcla de microorganismos deben emplearse técnicas de aislamiento lo que permite, obtenerlas en forma pura. Esto implica la utilización de medios tanto simples como especiales, mayormente sólidos de acuerdo con la naturaleza del microorganismo. 1.1. TÉCNICAS DE CULTIVO MICROBIOLÓGICO Las técnicas de cultivo se realizan por siembra o diluciones sucesivas: 1.1.1.

POR SIEMBRA: Es el procedimiento por el cual se pone en contacto al microorganismo con un medio de cultivo, para que, en condiciones óptimas de temperatura y tiempo de incubación, pueda desarrollar y multiplicarse in vitro. La finalidad es el aislamiento para tener un cultivo puro de bacterias a partir de una muestra problema (orina, heces, secreciones, agua servida). La siembra puede ser:

1.1.2.

•

Por inoculación

•

Por estrías simples

•

Por dispersión o agotamiento

•

Por puntura

POR DILUCIONES SUCESIVAS: Consiste en hacer diluciones seriadas de la muestra o del inóculo, ésta se utiliza cuando se tienen muestras líquidas (orina, agua), se realiza haciendo diluciones a las muestras: 1:100, 1:1 000, 1:10 000 etc. Luego se siembra cada dilución en placas de Petri con medios de cultivo. Una vez obtenidos los cultivos, se puede proceder al examen macroscópico, como la morfología de las colonias, actividades bioquímicas o características inmunológicas de los microorganismos aislados.

2

TECNICA DE SIEMBRA POR DILUCIONES SUCESIVAS

Tomado de Microbiología Tomo II de Granados 2da Edición

II.

III.

OBJETIVOS

•

Conocer y realizar las diferentes técnicas de siembra y aislamiento bacteriano.

•

Observar el desarrollo de bacterias aisladas a partir de un cultivo puro.

MATERIALES

•

Asa de siembra en aro y en punta

•

Tubos de vidrio de 16 x150mm

•

Tubos de caldo Nutritivo con cultivo mixto bacteriano: Staphylococcus aureus y Escherichia coli

•

Placas con agar Nutritivo, agar Sangre y agar Manitol salado

•

Tubos con caldo y agar Nutritivo

•

Suero fisiológico estéril

•

Mechero de Bunsen

3

IV.

METODOLOGÍA

1.

Manejo del asa bacteriológica o de siembra: El profesor demostrará el manejo adecuado del asa y explicará las precauciones que se deben tener en la toma de la muestra.

2.

Esterilizar el asa y dejarla enfriar para evitar quemar a las bacterias

3.

Sumergir el asa hasta el fondo del cultivo líquido, ya que en este lugar se encuentra una mayor concentración de microorganismos.

4.

Observar que al retirar el asa del tubo esté cubierta por una película líquida.

5.

El asa de siembra se toma del mango como si fuera un lápiz.

6.

La boca del tubo se flamea después de abrirlo y antes de cerrarlo

7.

El tapón del tubo se toma con el dedo meñique de la mano derecha

4.1. MÉTODO DE SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: AISLAMIENTO A PARTIR DE UN CULTIVO MIXTO

1. Con un lápiz graso marcar por detrás de la placa que contiene el agar, las líneas como está indicado en la figura Nº 1, por lo que quedarán tres sectores: el sector uno (1) el más pequeño de los otros dos, servirá para descargar el asa. 2.

Esterilizar el asa y obtener una asada de cultivo del medio líquido, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla.

3.

Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la placa de Petri y sembrar trazando una serie de líneas en zigzag muy cerradas a todo lo ancho del sector uno (1).

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Esto mismo se puede hacer colocando la placa de Petri sobre la mesa y con la palma de la mano, hacer un movimiento rápido para levantar el fondo que contiene el medio de cultivo, como lo indicará el profesor. 4.

Esterilizar el asa en el mechero. Girar la caja 90 grados, hasta que el sector uno (1) quede a la izquierda y el sector dos (2) hacia arriba. Sin volver a tomar el inóculo, trazar un zigzag un poco más abierto en el sector dos (2), invadiendo el sector uno (1) en las primeras líneas del zigzag, pero no en las últimas.

5.

Girar nuevamente la placa 90 grados, ahora el sector dos (2) estará a la izquierda y el sector tres (3) hacia la derecha.

6.

Hacer un nuevo zigzag en el sector tres (3), invadiendo el sector dos (2). Este paso puede repetirse sembrando un cuarto sector.

7.

Incubar las placas a 37º C durante 24 horas. Las placas ya sembradas deberán colocarse con la tapa hacia abajo y la parte que contiene el agar sembrado hacia arriba.

1

1

2

2

3

3

Figura Nº 2

Figura Nº 1

4.2. MÉTODO DE SIEMBRA EN CALDO DE CULTIVO

1. Coger el asa de siembra en aro, esterilizarla al mechero al rojo vivo y dejarla enfriar por unos segundos. 2. Abrir la placa que contiene el agar con el crecimiento bacteriano y con la ayuda del asa de siembra coger una colonia bien aislada (figura Nº 1). 3. Luego destapar un tubo con caldo de cultivo (figura Nº 2), coger la torunda, que está dentro de este con el dedo meñique de la mano con que se está cogiendo el asa de siembra con la colonia 4. Introducir el asa de siembra en el tubo y agitar suavemente hasta que se desprenda la colonia del asa de siembra. 5. Introducir la torunda, tapar el tubo, llevar a esterilizar el asa de siembra y homogeneizar bien el caldo.

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6. Llevar a incubar a 37º C por 12 horas.

Figura Nº2

Figura Nº1

7. Transcurrido el tiempo de incubación, observar el desarrollo bacteriano en los medios de cultivo líquido y sólido. • Medio líquido: la turbidez indica desarrollo • Medio sólido: presencia de colonias

1.2. AISLAMIENTO BACTERIANO •

DEFINICIÓN: Técnica usada en el Laboratorio para la transferencia de un microorganismo de un ambiente a otro con la finalidad de inducir su crecimiento para su identificación. Es la separación de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que se encuentran.

•

FUNDAMENTO: En el manejo de muestras contaminadas o cultivos mixtos en los que se encuentran diversos microorganismos, el primer paso para proceder a su estudio es el aislamiento, es decir la separación de cada uno de los posibles integrantes microbianos de la muestra. Existen diversos métodos para conseguir esta separación, la mayoría de ellos basados en la inmovilización de las células microbianas en la superficie de los medios de cultivo sólidos. Al depositar una célula bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo, ésta quedará inmovilizada en ese punto y en él se reproducirá por absorción de los nutrientes del medio. Las nuevas células generadas permanecerán igualmente inmóviles y tras sucesivas generaciones conformarán lo que denominamos una "colonia" que no es más que un montón de células derivadas de una sola célula madre inicial.

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V.

RESULTADOS

Realizar la lectura, observar y graficar los resultados. ▪ Staphylococcus aureus

Agar Nutritivo

Agar Sangre

Agar Manitol Salado

Agar Sangre

Agar Manitol Salado

Escherichia coli

Agar Nutritivo

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CUESTIONARIO

1. ¿Qué método de siembra usaría en cada uno de los casos siguientes?

• Cultivo de heces: • Cultivo de líquido cefalorraquídeo: • Contaje de colonias en urocultivo: 2. ¿Por qué el agar Nutritivo es un medio de uso general para el cultivo bacteriano? ¿Qué sustancias se le pueden agregar para hacerlo enriquecido para bacterias Gram positivas?

…………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………. …………………………………………………………………………………………………… 3. ¿Cuál es la importancia de un cultivo puro? …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………………………

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