Practica 7 de Siembra PDF

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1- Conocer y realizar diferentes formas de siembra
2- Realizar la técnica de agotamiento
3- Utilizar diferentes medos de cultivo para el aislamiento de microorganismos
4- Practicar la transferencia de inóculos
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Universidad de Guayaquil Facultad de Ciencias Químicas Carrera: Química y Farmacia Guía de Prácticas de Laboratorio MICROBIOLOGÍA I #7 Siembra y Métodos de Siembra y Antibiograma Docente: Q. F. María Fernanda Vélez León Msc. Alumno: ANTHONY BETANCOURT R. II Semestre: G3-A Ciclo: Objetivos de la práctica de laboratorio 1- Conocer y realizar diferentes formas de siembra 2- Realizar la técnica de agotamiento 3- Utilizar diferentes medos de cultivo para el aislamiento de microorganismos 4- Practicar la transferencia de inóculos Instrucciones o consideraciones previas La identificación bacteriana se realiza tras el estudio de las características de tinción, morfológicas y bioquímicas de los microorganismos. Con este fin, existen en el mercado una enorme variedad de medios de cultivos diseñados no solo para permitir el crecimiento y multiplicación de los microorganismos, sino también para inhibir los de otros (medios selectivos) o resaltar determinadas características metabólicas (medios diferenciales) que nos permitan establecer los fundamentos de algunas pruebas diferenciales. Los ambientes microbianos solo en raras ocasiones albergan una cepa única. Para identificar los microorganismos de un cierto hábitat, es preciso aislar cada especie en un cultivo puro, para lo cual es necesario realizar aislamiento en medios especiales, selectivos y diferenciales, y poder obtener un solo tipo de microorganismo identificándolo mediante pruebas bioquímicas o serológicas. El primer paso para el diagnóstico de un microorganismo es sembrar las muestras en un medio de cultivo adecuado para su desarrollo y utilizar una técnica de siembra para poder observar sus características macroscópicas y microscópicas como son las morfológicas y tintoriales Siembra Concepto: Depositar un inoculo o semilla en n medio de cultivo adecuado para que se desarrolle. Se necesita darle las condiciones físicas adecuadas como son temperatura, tiempo, oxigeno, pH, dependiendo de lo que requiere el microorganismo que se desea cultivar Métodos de siembra Se pueden distinguir dos tipos de siembra:  

En superficie: Corresponde a la modalidad más empleada. En profundidad: Se utiliza en las pruebas de identificación bacteriana

Las siembras se pueden realizar directamente desde una muestra clínica que contenga un microorganismo, desde otro cultivo bacteriano o desde un inoculo.

Inóculo: suspensión de bacterias en un volumen pequeño de generalmente es un caldo nutritivo básico o agua destilada.

medio líquido que

Forma correcta de sembrar en tubo

Las siembras se pueden realizar con diferentes elementos, entre ellos: a) Siembra con asa: Se puede realizar:   

Tomando un inóculo a partir de una suspensión de bacterias o para sembrar muestras biológicas líquidas (orinas, líquido cefalorraquídeo, etc.) Para formar una estría de crecimiento a partir de un inóculo realizado con hisopo. Para realizar traspaso de bacterias de un medio a otro, tomando directamente una porción de una colonia.

b) Siembra con hisopo: El hisopo está compuesto de algodón hidrófilo, lo que permite empapar este material con

el fluido en el que se desea estudiar una bacteria. Generalmente para que las bacterias permanezcan viables se utilizan medios de cultivo denominados "de transporte", en el que se sumerge el hisopo. La siembra se realiza depositando el hisopo sobre una sección de la placa y posteriormente se realiza la estría de crecimiento con asa. c) Siembra con pipeta Pasteur: Se realiza para sembrar bacterias en suspensión.

Aislamiento Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros. Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo y que procede generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia.

Técnicas Generales de aislamiento y cultivo de los microorganismos 1. Se aconseja que la siembra de todas las muestras a los medios de cultivos se realice bajo una cabina de flujo de aire laminar o en un gabinete de seguridad biológica, con los protectores de plástico o vidrio para el cuello y la cara, las muestras procesadas se las debe considerar como potencialmente infecciosas y manipularlos adecuadamente. 2. Se debe contar con todos los medios de cultivos necesarios para realizar las siembras. 3. Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el material de vidrio (en zonas estériles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor. Después de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar en todo su perímetro 4. Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas, antes y después de la inoculación. 5. Durante la inoculación, los tapones se mantienen en la mano sujetándolos por la parte que no entra en contacto con tubos y matraces. 6. Los tubos abiertos deben mantenerse en posición inclinada hacia el frente para que el riesgo de contaminación sea mínimo. 7. Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de trabajo boca arriba trabajando con bacterias. Resiembra periódica a medios nuevos

Los cultivos de bacterias se pueden mantener en tubos en los que han sido cultivados mediante pasos periódicos a medios nuevos. Cuando se va a utilizar este procedimiento para mantener una colección de cepas controles o para un estudio posterior, se deben considerar 3 parámetros antes de realizar la resiembra: 1. El medio de cultivo 2. Tiempo de incubación 3. Temperatura de incubación ANTIBIOGRAMA Para conocer la sensibilidad de una bacteria a distintos antibióticos se siembra una muestra del cultivo puro en un medio en el que conocemos la capacidad de difusión de cada una de las sustancias a testar. Este es el medio de Mueller Hinton. Reactivos de laboratorio - Alcohol Medios de cultivo / Cepas - Caldo nutritivo - Cepas varias - Agar Mac Conkey - Agar nutritivo -Discos de antibioticos Materiales de laboratorio 1- Algodón 2- Fósforos 3- Lápiz graso 4 - Hilo de inoculación 5- Asa de Inoculación 6 – Gradilla 7 -Hisopos estériles Equipos de laboratorio - Mechero de Bunsen - Incubadora - Refrigeradora Actividades por desarrollar/ técnica operatoria 1.- Prender el mechero bunsen para crear un área estéril y aplicar la técnica aséptica 2.- Coloca las placas en posición invertida sobre la mesa de trabajo para que se facilite manipularlas mejor. Técnica de siembra por estrías en placa 1.- Desinfectar el área de trabajo, ordenar el material de trabajo 2.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Tape la caja de Petri. 3.- Ahora, toma una placa con agar estéril (donde vayas a sembrar) y con cuidado de no romper el agar, inocula la muestra en un extremo de la placa y con el asa en posición ligeramente horizontal realiza las estrías (muy juntas), oscilando el asa de siembra sobre la superficie de una porción pequeña del agar; mediante un balanceo sucesivo y rápido de la muñeca. 4.- Esteriliza el asa de nuevo y déjala enfriar. Rozar una vez con el asa de siembra las estrías sembradas la primera vez y realiza sobre una porción virgen del agar una segunda tanda de estrías que no toque la primera.

5.- Repetir exactamente la operación descrita en el punto anterior, pero rozando al empezar la segunda tanda de estrías, hasta completar 3 o 4. No hagas más presión sobre el agar que la debida al propio peso del asa y su mango. Es importante emplear un asa de siembra en buen estado, pues una rota o deteriorada rasgará el agar. 6.- Lleva a la incubadora y deja en posición invertida 24 horas al término de las cuales se puede observar ya el desarrollo de colonias aisladas.

Sembrado por estrías en tubo inclinado 1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo de agar en pico de flauta (agar inclinado) y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular y flamea la boca del tubo. 3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y empezando en el área del fondo del agar realiza una estría hacia fuera hasta terminar en la punta del agar. Retira el asa. 4.- Flamea la boca del tubo de nuevo y coloca el tapón de algodón bien firme. Esteriliza el asa y déjala enfriar. 5.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra.

Sembrado por agitación en caldo 1.- Esteriliza el filamento del asa de siembra y toma la parte de la caja de Petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe el asa y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo con el caldo estéril y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular, flamea la boca del tubo. 3.- Introduce el asa con la muestra (cuidando de no tocar las paredes del tubo) y por agitación dentro del caldo, siembra el inóculo. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapón de algodón firmemente. Esteriliza el asa y déjala enfriar. 4.- Lleva a incubar y observa el desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra.

Sembrado en picadura en tubo vertical 1.- Esteriliza el filamento de la aguja de inoculación y toma la parte de la caja de petri que contiene el medio de cultivo sembrado. Cerca del mechero espera que se enfríe la aguja de inoculación y toma una colonia de la placa. Regresa la caja a su tapadera. 2.- Ahora toma el tubo con el medio de cultivo y cerca del mechero retira el tapón de algodón ayudándote con los dedos meñique y anular, flamea la boca del tubo.

3.- Introduce la aguja con el inóculo y sin tocar las paredes del tubo, inocula en el centro del medio de cultivo sin llegar hasta el fondo del tubo. Retira la aguja de inoculación en la misma dirección de la siembra. Retira el asa y flamea de nuevo la boca del tubo y coloca el tapón de algodón firmemente. Esteriliza el asa y déjala enfriar. 4.- Lleva a incubar y observa las características del desarrollo a las 24 o 48 horas después de la siembra. Procedimiento N o 2 Aislamiento en medios Selectivos e Inhibidores Siembre por agotamiento por estrías múltiples combinada: Agar Manitol sal Agar Mac Conkey Luego de realizar estas siembras (placas y suspensiones) incube en estufa a 37º C durante 24 horas, tras las cuales debe evaluar el crecimiento bacteriano. Procedimiento N.º 3: Siembra de muestras biológicas 1. Realice una toma de muestra de secreción nasal de alguno de los integrantes del grupo. 2. Siembre la muestra en las mitades restantes de las placas de agar sangre y Mac Conkey e incube durante 24 horas a 37º C. PROCEDIMIENTO DE ANTIBIOGRAMA Para la realización de la prueba en primer lugar hay que sembrar el medio con una gran carga bacteriana que nos permita obtener un crecimiento en tapiz o césped. La siembra se realiza mediante un hisopo estéril que se empapa con el cultivo líquido o se impregna en un cultivo sólido. Se descarga el hisopo realizando una estrella en el centro de la placa y extendiéndola posteriormente por toda la superficie procurando que no queden espacios sin cubrir. Una vez sembrada la placa se eligen los antibióticos a testar. Los antibióticos vienen en impregnados en discos de papel absorbente que se sacan con pinzas metálicas esterilizadas mediante su flameo tras inmersión en alcohol (LEFAZOLINA, OXACILINA, CEFALEXINA, NAFCILINA). Los discos se depositan en la superficie del medio de cultivo inoculado, realizando una ligera presión para que queden adheridos al mismo. Hay que procurar que queden suficientemente separados unos de otros para que la lectura de resultados sea clara y no haya interferencias entre la acción de unas sustancias y otras. La placa preparada con el inóculo y los antibióticos se invierte y se lleva a incubar durante 24 horas a 37ºC. Tras este tiempo, se leen los resultados midiendo el diámetro de los halos de inhibición del crecimiento que aparecen alrededor de los discos de papel. Se valora la efectividad de los mismos consultando la tabla correspondiente en la que, según el antibiótico, tenemos la capacidad de difusión en el medio y por tanto, la medida de halo que corresponderá a una bacteria sensible, moderadamente sensible/de sensibilidad intermedia, o resistente. Resultados obtenidos (Observaciones, cálculos, datos, ecuaciones, tablas, gráficos, figuras, fotos)

ILUSTRACIÓN 1 PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO EN CAJA PETRI

ILUSTRACIÓN 2 CAJA PETRI CON MEDIO DE CULTIVO

Ilustración 3 MATERIALES PARA ANTIBIOGRAMA

Ilustración 4 HALOS DE LOS DISCOS DE ANTIBIOTICOS

Ilustración 7 ADICION DEL CULTIVO

Ilustración 5 SE AÑADE EL DISCO DE ANTIBIOTICO

Ilustración 8RESULTADO DESPUES DEL TIEMPO

Ilustración 6 ANTIBIOGRAMA

Ilustración 10 MATERIALES PARA SIEMBRA

Ilustración 9DILUCION DE SIEMBRA

Ilustración 11 RESULTADO DESPUES DE LA INCUBACION

Conclusiones Aplicamos los diferentes medios de cultivo, utilizando los métodos aprendidos en la manipulación de los instrumentos, inóculos, y material contenedor de la fuente nutricional con el cual se dará el crecimiento correcto de los diferentes tipos de microorganismos considerando así las condiciones óptimas en el proceso de incubado. Realizamos el antibiograma para conocer la sensibilidad de bacterias ante antibióticos formando halos de diferentes tamaños. Recomendaciones Al momento de tomar la cepa y realizar el sembrado ya sea con el asa o con el hisopo, aplicar y mantener un ambiente estéril en cada una de las etapas previas a la aplicación de estriado en los diferentes medios de cultivo Bibliografía Granados R., Microbiología, Ed. Paraninfo 1999

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