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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

BIOLOGÍA MOLECULAR Practica Nº 3 EXTRACCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICOS Grupo: B2 Alumno: Hilaccama Mayta, Aimar Edson Docente: Dr. Frey Romero Vargas Fecha de entrega: 11/05/2021

PRACTICA Nº3 EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS 

OBJETIVOS OBJETIVOS GENERALES  CONOCER PROCEDIMIENTOS BÁSICOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR PARA LA PURIFICACIÓN Y EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS. OBJETIVOS ESPECIFICOS  UTILIZAR TÉCNICAS PARA PODER EXTRAER ÁCIDOS NUCLEICOS DE UN TEJIDO ANIMAL Y VEGETAL.  DEFINIR LA FUNCIÓN DE DIFERENTES REACTIVOS USADOS EN LA EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

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INTRODUCCIÓN Uno de los procedimientos básicos en biología molecular es la purificación y extracción de moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA), como primer paso para posteriores análisis. Son varios los métodos utilizados para la extracción de ácidos nucleicos. En general, todos tienen el mismo principio; es decir, empiezan con una forma de lisis celular seguido por una remoción de proteínas y por último la obtención de DNA de alta pureza por precipitación etanólica. Las variaciones que presentan los diferentes métodos dependen del tipo de célula con la que se trabaja. En muchos casos, la liberación de ácidos nucleicos puede ser fácil, cuando se trabaja con virus y con algunas bacterias como Mycoplasma y E. coli; sin embargo, resulta más complicada con ciertos organismos como el Mycobacterium tuberculosis, debido a sus características particulares de la membrana celular.

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REACTIVOS USADOS PARA LA EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS ß-MERCAPTOETANOL El ß -mercaptoetanol se emplea en algunos protocolos de aislamiento de RNA para eliminar ribonucleasas liberadas durante la lisis celular. Ello se debe a que las ribonucleasas son proteínas estabilizadas mediante numerosos puentes disulfuro.

La acción del ß -mercaptoetanol desnaturaliza irreversiblemente estas moléculas, lo cual previene la digestión del RNA durante el procedimiento.

SARKOSIL Se utiliza generalmente si se realiza un procedimiento de lisis en condiciones de refrigeración (significativamente más bajas que la temperatura ambiente). También se utiliza para desnaturalizar proteínas y alterar las membranas biológicas.

NP40 Es

un detergente disponible

comercialmente con número

de

registro

CAS 9016-45-9. NP-40 es un nonilfenol etoxilado para tensioactivos no iónicos y puede actuar como agente emulsionante y desemulsionante. Se usa a menudo para romper todas las membranas dentro de una célula, incluida la membrana nuclear.

EDTA El EDTA se usa para quelar los iones positivos de magnesio, manganeso y calcio dentro de la célula. Así, la nucleasa se ata al EDTA en vez de atarse al grupo fosfato entre los ácidos nucleicos y se previene que quiebre los mismos, así estabilizando el ADN. A la vez, destabiliza la membrana al romper las moléculas hidrofóbicas presentes en la misma.

ETANOL El alcohol disminuye la constante dieléctrica del solvente acuoso, provocando una disminución en la solubilidad del ADN, que, en presencia de altas concentraciones de sales, precipita. Este método es ampliamente utilizado como una forma de concentrar ADN.

SOLVENTES ORGANICOS (FENOL – CLOROFORMO) Este protocolo permite la purificación de ADN mediante la adición de fenol y cloroformo lo que da lugar a la aparición de 2 fases: una fase acuosa superior que contiene los ácidos nucleicos y una fase orgánica que contiene las proteínas disueltas en el fenol y los lípidos disueltos en el cloroformo.

DETERGENTE (SDS) El detergente disuelve las grasas o lípidos, que es el componente principal de la membrana plasmática y nuclear de las células (es el mismo principio por el que el gel limpia la grasa de nuestra piel). Al romperse las membranas celulares se permite la salida del ADN al exterior....