Práctica No2 - PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO PDF

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PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO

PRÁCTICA No.2 PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO EQUIPO No2 CASTRO HERNANDEZ ROSA ELENA GONZALEZ LOPEZ ALBERTO Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP), Facultad de Ciencias Químicas (FCQ), Licenciatura en farmacia RESUMEN La prueba de promoción de crecimiento es empleada en todos los medios de cultivo para verificar que éstos cumplen con la función de permitir el desarrollo microbiano, aún en concentraciones bajas de microorganismos Para esta evaluación se debe utilizar al menos un microorganismo capaz de crecer, donde dicho microorganismo debe ser capaz de crecer en medios selectivos y presentar características de diferenciación y otro microorganismo para el cual su crecimiento sea inhibido Las cepas de colección son microorganismos definidos por lo menos a nivel de género y especie, depositados y mantenidos en una Colección de Cultivos (CC) o Centro de Recursos Biológicos (BRC) y catalogados con el acrónimo de la colección/BRC seguido de un número identificativo. En dicho catálogo se reseña el origen de la cepa, sus condiciones de cultivo y, en muchas ocasiones, algunas de sus características, así como la equivalencia, si la hay, con otras colecciones. Es equivalente a cepas de referencia. Esta prueba se aplica para las industrias farmacéuticas y de alimentos para garantizar que sus productos estén en un rango adecuado de resultados axénicos u óptimas condiciones conforme a los procedimientos normalizado de operaciones PNO’s establecidos y referente a la farmacopea. PALABRAS CLAVES Crecimiento Cultivos Pruebas Cepas Axénicos

SUMMARY The growth promotion test is used in all culture media to verify that they fulfill the function of allowing microbial development, even at low concentrations of microorganisms. For this evaluation, at least one microorganism capable of growing must be used, where said microorganism must be able to grow on selective media and present differentiation characteristics and another microorganism for which its growth is inhibited. Collection strains are microorganisms defined at least at the genus and species level, deposited and maintained in a Culture Collection (CC) or Biological Resources Center (BRC) and cataloged with the collection acronym / BRC followed by a number identifying. This catalog describes the origin of the strain, its cultivation conditions and, on many occasions, some of its characteristics, as well as the equivalence, if any, with other collections. It is equivalent to reference strains. This test is applied to the pharmaceutical and food industries to guarantee that their products are in an adequate range of axenic results or optimal conditions according to the established PNO's standard operating procedures and referring to the pharmacopoeia. KEYWORDS Increase Crops Tests Strains Axenic

Introducción. Los medios de cultivo de cultivo deben cumplir con lo establecido en la normatividad vigente. Al adquirir un medio, éste debe contener las especificaciones de calidad, como son: el nombre, la lista de componentes con las cantidades, la fecha de caducidad, el número de lote y las condiciones de almacenamiento. La calidad de los medios de cultivo preparados en el laboratorio depende de la formulación correcta, de los procedimientos de preparación, de la eliminación de los agentes microbianos contaminantes, de las condiciones adecuadas de envasado y almacenamiento. Además, se debe verificar que tengan las características adecuadas con respecto: a) Esterilidad. b) Propiedades físicas: pH, color. c) Productividad o promoción de crecimiento: Recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés. d) Selectividad: Inhibición de los microorganismos no deseados. e) Porcentaje de recuperación bacteriana: Es el rendimiento o recuperación de un microorganismo que se espera que se desarrolle en el medio. La evaluación de la calidad de los medios de cultivo es un requisito esencial en los laboratorios de microbiología, se basa en el crecimiento de los microorganismos viables seleccionados para la prueba. La promoción del crecimiento es parte del Control de Calidad, es un ensayo in vitro que se realiza para todos los medios de cultivo líquidos o sólidos, adquiridos comercialmente listos para ROSA CASTRO HERNANDEZ - ALBERTO GONZALEZ LOPEZ MICRO FARMACÉUTICA FARMACIA PRIMAVERA 2021

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usar, así como los que se preparan en el laboratorio a partir de productos comerciales deshidratados, o los que se preparan a partir de sus componentes. El ensayo debe ser realizado tomando en consideración, las siguientes características: a) Condiciones asépticas y equipos calificados (campanas o cabinas de seguridad biológica o módulos de flujo laminar o aisladores) b) Personal calificado c) Incluir control microbiológico (ambiental) de las áreas de trabajo y del personal durante el periodo de análisis d) Incluir controles negativos de los medios, diluyentes y soluciones de enjuague empleados e) Sanitizar los envases de las muestras, soluciones y medios de cultivo previo al análisis f) Todo material que esté en contacto con la muestra debe ser estéril g) Emplear procesos de esterilización validados h) Excepcionalmente, los diluyentes como agua, solución salina o agua peptonada, por ejemplo, no requieren que se les realice la prueba de promoción del crecimiento, pero deben confirmar su esterilidad. Importante: Los resultados deficientes de una prueba de promoción de crecimiento, no pueden usarse para sustentar los resultados positivos de la prueba.

Desarrollo de la práctica Equipo personal y material

Objetivos

Equipo de protección personal: Bata de laboratorio, guantes, lentes Varilla de vidrio en ángulo recto Competencias de seguridad y cubrebocas Gradillas para tubos de ensaye para desarrollar: Estufa bacteriológica con temperatura controlada (20 oC a 35 oC) Tubos de caldo soya tripticaseina (TSB) Asegura las Desinfectante y sanitas Placas preparadas de agarpropiedades soya tripticaseina (TSA) los Algodón Placas preparadas de agarnutritivas dextrosadeSabouraud lotes nuevos de Mecheros Bunsen Suspensión de cepas de referencia en caldo soya tripticaseina (≤ 100 ufc) medios de cultivo Marcador de tinta indeleble a) Bacillus subtilis ATCC 6633 (listos para usar o Micropipetas (1000 µL) y puntas azules b) Cándida albicans ATCC10231 preparados en el Micropipetas (100 µL) y puntas amarillas c) Aspergillus brasiliensislaboratorio ATCC16404 a partir de productos comerciales deshidratados) realizando pruebas de desafío frente a un panel de microorganismos de referencia específicos. Desarrollo Para obtener el inóculo a concentración ≤ 100 UFC 1.-Transfiere 1 mL del cultivo líquido con crecimiento del microorganismo de prueba y adicionarlo en un tubo conteniendo 9 mL del diluyente 2.-Realiza las diluciones seriadas con factor 1/10 subsecuentes necesarias para obtener un inóculo de ≤ 100 ufc 3.-Homogeniza los tubos durante 10 s con ayuda de un agitador (Vórtex) 4.-Cambiar las puntas azules estériles para cada dilución, inoculando 1 mL de la muestra simultáneamente en las cajas Petri estériles que se hayan seleccionado. 5.- Realiza diluciones necesarias que garanticen que se tiene la concentración deseada (≤ 100 ufc), y hacer un vertido en placa por duplicado como control. Para la inoculación de los tubos de caldo soya tripticaseina (TSB) ROSA CASTRO HERNANDEZ - ALBERTO GONZALEZ LOPEZ MICRO FARMACÉUTICA FARMACIA PRIMAVERA 2021

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a) Del tubo de dilución que contenga una concentración ≤ 100 ufc, inocular 0.1 mL a los tubos de caldo soya tripticaseina (TSB) preparados del medio de cultivo del lote anterior y del lote nuevo.

Para la inoculación de las placas de agar soya tripticaseina (TSA) y agar dextrosa Sabouraud b) Inocular 0.1 mL a las placas de agar soya tripticaseina (TSA) preparadas del medio de cultivo del lote anterior y el lote nuevo, extender en todas las direcciones con la varilla de vidrio, realizar esta operación por duplicado. c) Incubar los tubos y las placas en posición invertida, durante 24 – 48 horas a 35 °C para el desarrollo de bacterias y 5 días a 20 ° C a 25 ° C para levaduras y mohos. Interpretación (Método cualitativo) Para los tubos de caldo soya tripticaseina (TSB) 1.- Para incluir la prueba de presencia / ausencia. 2.- El método de prueba se considera aceptable si es capaz de recuperar cada uno microorganismos específicos inoculados, comparar crecimiento, turbidez. Interpretación Método cuantitativo (Enumeración como conteo en placa). Para las placas de agar soya tripticaseina (TSA) y agar dextrosa Sabouraud: 1.- El método de prueba se considera aceptable si la placa de vertido recupera un número aceptable de cada cultivo de prueba en comparación con el control. El cultivo de prueba no puede diferir del control por un factor ≥ 2. Ejemplo 1: Promedio de la cuenta control = 22 ufc. Promedio de la cuenta de la prueba = 18 ufc. El método se considera adecuado. 18/22 = 82% recuperación. Ejemplo 2: Promedio de la cuenta control = 14 ufc. Promedio de la cuenta de la prueba = 18 ufc. El método se considera adecuado. 18/14 = 129% recuperación. Ejemplo 3: Promedio de la cuenta control = 48 ufc. Promedio de la cuenta de la prueba = 18 ufc. El método no se considera adecuado. 18/48 = 38% recuperación. Ejemplo 4: Promedio de la cuenta control = 40 ufc. Promedio de la cuenta de la prueba = 98 ufc. El método no se considera adecuado. 40/98 = 245% recuperación.

Imagen 1: se observan las diluciones que se le da a la muestra y el tiempo para reaccionar al crecimiento adecuado de la muestra.

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Resultado A continuación, se contará cuántas ufc se formaron en nuestra muestra de la práctica dos, conforme los procedimientos adecuados.

Imagen del equipo 2: se observan la formación de 59 conteo en el agar en el cual se inoculó con la bacteria con 150 UFC/ml de Escherichia coli conforme a la cepa de ATCC se dio el Porcentaje de efectividad de 39.33% llegando casi a la efectividad deseada de la cepa.

150 UFC = 100% 59 UFC =X por lo tanto por regla de 3 el porcentaje es de 39.33%

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Cuestionario 1.- ¿Qué es promoción del crecimiento? Es un ensayo in vitro como parte del control de calidad que se realiza a cada lote de medio de cultivo ya sea líquido o sólido, adquiridos o preparados. El propósito de la prueba es determinar la susceptibilidad del medio de cultivo usando diferentes pruebas microbiológicas. Se especifican los ensayos necesarios para investigar los microorganismos especificados en tablas un ejemplo serían cepas ATCC presentes en cualquier tipo de materia prima o producto farmacéutico no obligatoriamente estéril. En caso de no seguirse la metodología descrita, pueden ser utilizados otros procedimientos microbiológicos, incluidos los métodos automatizados, a condición de que su equivalencia al método de esta Farmacopea haya sido demostrada o validada según corresponda.

2.- ¿Con qué frecuencia se debe realizar la prueba de promoción de crecimiento? El término crecimiento en las bacterias se refiere a cambios cuantitativos en la población total de las bacterias, es decir un aumento en la masa total de células, más bien que a cambios en un organismo en forma individual, con frecuencia el inóculo contiene miles de organismos y el crecimiento sólo denota el incremento del número o de la masa por encima del inóculo original. El método característico de reproducción bacteriana es la fisión binaria; una célula se divide en dos, en este caso, si se parte de una sola bacteria, el incremento de la población se hace en progresión geométrica: una bacteria produce dos, dos dan cuatro, cuatro dan ocho; ocho dan dieciséis y así sucesivamente. El tiempo de generación se refiere al intervalo de tiempo requerido para que la célula se divida, o lo que es lo mismo, para que la población se duplique. Muchos estudios bacteriológicos requieren la determinación del número de bacterias presentes en una unidad de volumen. Los recuentos se pueden efectuar por diferentes métodos, ya sea contando sólo células vivas o también vivas y muertas. La cantidad y tipo de microorganismos en una muestra dependen de la composición química de la misma y de los tratamientos a que haya sido sometida. El método de conteo elegido depende de los recursos con los que se cuente, de esta forma se puede determinar la presencia o ausencia de microorganismos, así como su número presente en el material de estudio, un conteo total establece el grado de contaminación microbiana, conociendo el número se puede estandarizar la concentración de inóculos y seguir la dinámica poblacional de un cultivo puro y muchos otros estudios

3.- ¿Qué indica una prueba de promoción de crecimiento deficiente? El control de la esterilidad de un lote de medio de cultivo puede llevarse a cabo difiriendo su uso por 24 horas desde su preparación, y observando la ausencia de crecimiento. No obstante, ya que esta prueba solo es indicativa de contaminación masiva y principalmente de origen bacteriano, se recomienda también incubar 4% de los tubos o cajas preparadas durante un tiempo prolongado (entre 5 y 7 días) y a temperatura que favorezca el desarrollo de bacterias como de hongos (37 y 25 °C, respectivamente). Como esta prueba daría resultados extemporáneos al trabajo adecuado, es primordial contar con un sistema adecuado de validación de los procesos de esterilización, que incluya el uso de indicadores no sólo químicos sino también biológicos. Conviene recordar que la cinta testigo no indica el tiempo de exposición de los materiales a cierta temperatura, y su vire ocurre a temperatura inferior a la de esterilización. La presencia de contaminación de un lote de medio preparado puede indicar no solo esterilización deficiente, si no también contaminación postesterilización, como durante el envasado, o bien el empleo de aditivos contaminados que se agreguen a las bases.

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4.- ¿Qué indica la idoneidad del método no válido? Validar un método es básicamente el proceso para definir un requisito analítico, y la confirmación de que cuenta con capacidades consistentes con las aplicaciones requeridas. Inherente a esto está la necesidad de evaluar el desempeño del método. Es importante la valoración de la idoneidad del método; en el pasado la validación del método se centraba solo en la evaluación de las características de desempeño. Las actividades de validación de métodos y el desarrollo de métodos están estrechamente ligadas. Muchas de las características de desempeño (Tabla 2) que se evalúan durante la validación, también lo son en mayor o menor medida, durante el desarrollo del método. Sin embargo, es importante recordar que debe realizarse la validación formal de la versión final del método (el procedimiento

documentado). Algunos sectores utilizan los conceptos de ‘validación primaria’ y ‘validación secundaria’, esta última con el sentido de verificación. Los conceptos de ‘cualificación’ y ‘confirmación metrológica’ también cubren el sentido de verificación (Tabla 1).

Conclusiones ROSA CASTRO HERNANDEZ - ALBERTO GONZALEZ LOPEZ MICRO FARMACÉUTICA FARMACIA PRIMAVERA 2021

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La promoción del crecimiento es una técnica que nos ayuda a realizar una prueba fiable para saber si los procesos normalizados de operación son los idóneos para nuestra cepa ATCC y hacer los 5 pases para un control adecuado de nuestro microorganismo a ensayar; y saber que efectividad tenemos en el crecimiento de la cepa como pruebas microbiológicas para dar autorización o retención del producto terminado y así por ejemplo un lote de medicamentos o alimentos enlatados. En el caso de la paca nos tocó el rendimiento es muy bajo incluso menor a 50% por lo cual creemos que es conveniente regresar el lote. Por ejemplo Escherichia coli se debe inocular en caldo digerido de caseína alrededor de una temperatura de 32.5 a más menos 2.5 C e inocularlo a un tiempo de 18 a 24 hrs para que la recuperación microbiana en el tiempo de inoculación es de alrededor de los 3 a 5 días, con lo cual también para certificar nuestros PNO’s la certificación de referencia debe ser de una colección certificada cuidando la temperatura el tempo en el cual se trabaja nuestra muestra para no obtener resultados falsos positivos y sean los resultados deseados de crecimiento y buena certificación del ensayo o de la prueba.

Imagen 2: se observan los pases de inoculación.

Referencias Manual de microbiología farmacéutica UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES “ZARAGOZA” Manual electrónico de control de calidad en medios de cultivo y cepas de referencia T E S I S Para obtener el título de: Química Farmacéutico Bióloga Castillo Carranza Karla Eugenia Farmacopea pág. 84 ENSAYOS PARA LA INVESTIGACIÓN DE MICROORGANISMOS ESPECÍFICOS Versión de HTML Básic https://www.argentina.gob.ar/anmat "EVALUACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO PARA VERIFICAR SU REPRODUCTIBILIDAD Y SELECTIVIDAD JANETTE ESMERALDA CAMPOS RADILLO

Guía Eurachem La Adecuación al Uso de los Métodos Analíticos Una Guía de Laboratorio para Validación de Métodos y Temas Relacionados Segunda Edición Inglesa Primera Edición Española

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