Práctica secreción de ácido p-amino hipurico PDF

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Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Departamento de Farmacia Laboratorio de Farmacología General y QuimioterapiaPráctica No. 9 “Secreción activa del ácido p-amino hipúrico en las rebanadas de Corteza renal de rata” Equipo: 3RESÚMENLa secreción tubular renal es un p...

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Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas Departamento de Farmacia Laboratorio de Farmacología General y Quimioterapia Práctica No. 9 “Secreción activa del ácido p-amino hipúrico en las rebanadas de Corteza renal de rata” Equipo: 3

RESÚMEN La secreción tubular renal es un proceso activo en el que se requiere energía metabólica y en la mayoría de los casos se lleva a cabo por un gradiente de concentración. El ácido p-aminohipúrico (PAH) es utilizado como un marcador de la vía de secreción de los aniones orgánicos que se lleva a cabo en el túbulo proximal del riñón. La presencia de un grupo amino permite utilizar el método de Bratton y Marshall para una cuantificación (Método colorimétrico).Los resultados esperados indican que debido a las características de los reactivos se obtendría en orden decreciente la media de t/m (tejido/medio) de las diferentes cámaras: PAH (únicamente)> Probenecid>2,4-DNF>Sin 𝑂2 ; sin embargo por factores no controlados se obtuvieron resultados similares con algunas variaciones en el orden. INTRODUCCIÓN A la secreción tubular se le define como el transporte de una sustancia de la sangre peritubular hacia la luz tubular. Se trata de un mecanismo muy eficaz para eliminar sustancias de desecho, fármacos y sustancias tóxicas. Si por alguna razón se modifica, se afecta la cinética de eliminación, alterando, por ejemplo, el efecto farmacológico de los compuestos que utilizan esta vía de eliminación. La secreción tubular es un proceso activo que en la mayoría de los casos se lleva a cabo contra un gradiente electroquímico; es unidireccional, saturable, requiere suministro de energía aportada por el metabolismo celular y puede estar sujeto a inhibición competitiva entre dos o más compuestos [1]. (Fig. 1) Existen 3 mecanismos de secreción tubular: a) secreción activa con limitación absoluta de la capacidad de transporte, b) secreción activa con limitación de la capacidad de transporte de tipo gradiente-tiempo, c) secreción pasiva [1].

Fig. 1. La excreción neta de una sustancia es el resultado final de tres procesos fundamentales: la filtración glomerular, la secreción y la resorción tubular.

El ácido p-amino hipúrico es utilizado como un marcador de la vía de secreción de los aniones orgánicos. Cuando se administran dos fármacos que se secretan por el mismo mecanismo, se establece competencia por el transportador [1].

6FM2 El probenecid es un medicamento uricosúrico que compite con otros medicamentos en el proceso de secreción tubular, lo que puede incrementar los efectos tóxicos de otros fármacos al retrasar su eliminación, pero esa competencia puede utilizarse en terapeútica, al causar que el medicamento permanezca un mayor tiempo en el organismo y pueda tener un efecto farmacológico mayor [2]. El 2,4-dinitrofenol es un agente desacoplante. Los agentes desacoplantes actúan como ácidos lipofílicos débiles, que se asocian con protones en el exterior de la mitocondria, pasando a través de la membrana unidos a un protón, y se disocian de éste en el interior de la mitocondria. Estos agentes causan tasas de respiración máxima pero el transporte de electrones no genera ATP, debido a que los protones translocados no regresan a la matriz mitocondrial a través de la ATP sintasa [3]. La corteza renal forma un escudo alrededor de la médula. Sus tejidos se mezclan con la médula entre las pirámides renales adyacentes para formas las columnas renales. La apariencia granular de la corteza se debe a la acomodación al azar de diminutos túbulos asociados con los nefronas, las unidades anatómicas y funcionales básicas del riñón [4]. OBJETIVOS  Cuantificar la acumulación de Paminohipurato en rebanadas de corteza de riñón de rata y determinar cómo dicha acumulación se ve afectada por la presencia de probenecid o por inhibidores metabólicos como el 2,4-dinitrofenol HIPÓTESIS  Si en la cámara A se coloca únicamente Ringer, entonces no habrá proceso de secreción tubular  Si en la cámara B se coloca el PAH únicamente, entonces se

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espera que se observe el proceso normal de secreción tubular y que ésta tenga el valor más alto de t/m Si en la cámara C se coloca el PAH junto con el Probenecid, entonces el valor de t/m que presente esta cámara será menor al valor obtenido en B Si en la cámara D se coloca PAH y 2,4-DNF, entonces se espera que el valor de t/m sea muy pequeño o menor comparado con el de las dos cámaras anteriores Si en la cámara E se coloca PAH y no se oxigena la cámara, entonces el valor obtenido será de secreción pasiva

DESARROLLO Se prepararon cinco cámaras, la cámara A contenía 10mL de solución Ringer (blanco), la cámara B contenía 0.1mL de PAH 0.1M y 9.9mL de solución Ringer, la C 0.1mL de PAH 0.1M, 1.0mL de Probenecid 0.1M y 8.9 de Ringer, la D 0.1mL de PAH 0.1M, 0.1mL de 2,4-DNF 0.1M y 9.8mL de Ringer y la cámara E contenía 0.1mL de PAH 0.1M y 9.9mL de solución Ringer y estaba desprovista de oxígeno. Se sacrificó una rata Wistar hembra adulta por decapitación, previamente anestesiada con éter etílico, se disecaron los riñones rápidamente sin tener demasiada manipulación para evitar dañar al órgano, colocándolos en Ringer frío (aprox. 4°C), se decapsularon con cuidado, para después cortar en trozos pequeños y finos de corteza; se colocaron en Ringer frio, con un pH de 7.4 con oxigenación constante (excepto la cámara E). Los trozos de la corteza renal se colocaron en las diferentes cámaras, mas o menos 10 pequeñas rebanadas, incubándose a 25°C, con burbujeo constante de 𝑂2 y 𝐶𝑂2 , en un tiempo de una hora, excepto a la cámara “E” (sin 𝑂2 ) . Terminado el período de

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incubación, se secaron las rebanadas ligeramente sobre papel filtro para eliminar el exceso de Ringer. Después se colocaron en tubos Eppendorff , se pesaron sacando así el peso húmedo. En tubos de rosca con 4.5 mL de agua bidestilada se colocaron los trozos recuperados. Se adicionó 0.25mL de sulfato de zinc (precipitación de proteínas) y se agitó perfectamente, se dejó reposar 10 min, se centrifugó a 3000 rpm durante 20 minutos; posteriormente se toman alícuotas de 3mL del sobrenadante se le adicionó los siguientes reactivos: -0.2 mL de HCl 1.5N, hasta un pH ácido. -0.1mL de Solución de nitrito de sodio, se agitó y se dejó reposar 5 min aprox. -0.1mL de la solución de sulfamato de amonio, se agitó y se esperó 5 min aprox. -0.1mL de la solución de N-(1-naftil) etildiamina diclorohidrato y agitar. Se dejó reposar 20 min en la oscuridad y se determinó la absorción de la luz a 540 nm. RESULTADOS

Relación (t/m)

10 8 6 4 2

E

D

C

¨ B

B

0

Grupos

Figura 1. Relación t/m de las diferentes cámaras usadas.

DISCUSIONES Tomando en cuenta que el PAH es un marcador de la vía de secreción se observa que en B la relación (t/m) alcanza un valor aproximado de 7, nos

quiere decir que hay secreción activa, esto es porque al someter el tejido a condiciones aerobias y al no haber administrado otro fármaco que se secrete por el mismo mecanismo no hay competencia por el transportador, así el PAH se secreta activamente por la acción del oxígeno y la generación de ATP al contener la solución Ringer glucosa. [5] Las condiciones de B´fueron iguales a las de B por lo tanto ocurrió algo similar con lo ya citado anteriormente, sólo que la relación t/m fue menor pero el valor aún así indica que el transporte fue activo. En el caso de la cámara C, hay transporte activo, sin embargo no se está secretando el PAH ya que el Probenecid agregado a dicha cámara bloquea competitivamente el transporte activo del PAH, por lo que lo que se secreta es el Probenecid y no el PAH, debido a que existe mayor afinidad del Probenecid por el transportador. [6] En la cámara D al contener 2, 4-DNF que es un inhibidor de la producción de ATP aunque la cámara tuviera oxígeno se supondría que no hay secreción activa ya que no hay ATP que se pueda utilizar, sin embargo la relación t/m muestra que si hay transporte activo, esto puede deberse a que el tejido podría contener ATP ya formado el cual provocó el transporte activo aun en presencia del 2,4-DNF porque su concentración no fue suficiente para bloquear por completo el proceso. [7] Por último la cámara E correspondiente a la que no se administro O2 muestra la menor relación t/m ya que poco a poco el tejido fuera muriendo esto servirá de estándar para ver que el O2 no interfiere con el transporte activo.

6FM2 BIBLIOGRAFÍA 1. Muñoz, J. Fisiología: Células, órganos y sistemas.(1997). México: Secretaría de Salud. Tomo III. Pp. 217-221 2. Repetto, M. Toxicología Fundamental. (2009). 4ª ed. Días de Santos.Pp. 375 3. www.ucla.edu.ve/dmedicin/DEP ARTAMENTOS/.../Reabsorcion. ppt 4. M. Bloch-UNAM, Medicina, UNAM. Dr. Jacinto Santiago Mejía. Noviembre de 2010 farma.facmed.unam.mx/extras/d escargas/archivos/.../excrecion. ppt 5. Posadas del Rio Francisco, “Fisiología, células, órganos y sistemas”, 1ª edición; México 1997; p.p 216-217. 6. Tripathi, “Farmacología en odontología”, Editorial Medica Panamericana, Buenos Aires 2008; p.p 329 7. Teijón Rivera José María, “Bioquímica Estructural” , Editorial Tebar, p.p 328.

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